ELISA DE HEPATITIS

EXAME ELISA DE HEPATITE A

INTRODUÇÃO

A aula pratica foi realizado no dia 29 de outubro, no laboratório de Análises Clínicas, sob a orientação da professora Neusa Mariana.

O vírus da hepatite A (HAV) é um vírus de RNA de cadeia simples, sem envelope e com um diâmetro de 27 nm, que pertence à família Picornaviridae e ao gênero Hepatovírus.

A infecção pelo vírus da hepatite A é de transmissão fecal-oral, que pode ser relativamente rara nos países ocidentais industrializados devido ao alto padrão higiênico. Os europeus ocidentais adquirem esta infecção principalmente pelo consumo de bebidas e alimento contaminado (especialmente moluscos) durante viagens a países do hemisfério sul. Este vírus é altamente endêmico em muitos países em desenvolvimento e a infecção é adquirida precocemente na infância.

A excreção viral se dá pelas fezes especialmente pouco antes e durante o início da doença. Durante este período também ocorre uma viremia transitória. Entretanto, o diagnóstico de infecção recente e a detecção de imunidade contra a hepatite A estão baseados principalmente na detecção de anticorpos. A técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é indicada como um método de triagem para detectar anticorpos contra a hepatite A.

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

Durante a aula de estágio foi ministrada o procedimento correto para a realização do exame de Elisa, que foi aplicado sobre a Hepatite A.

O exame Elisa HAV é um método imunoenzimático competitivo para a determinação de anticorpos contra o vírus da hepatite A no soro ou plasma.

O ensaio está baseado na competição entre os anticorpos anti-HAV presentes na amostra e anticorpos monoclonais anti-HAV conjugados com peroxidase, quando são incubados simultaneamente nos pocinhos de uma microplaca recoberta com passará a amarelo depois do bloqueio da reação com ácido sulfúrico. A presença de anti-HAV na amostra reduz o desenvolvimento de cor de forma proporcional a sua concentração HAV. Após a incubação, lava-se para eliminar o material não fixado e em seguida adiciona-se uma solução de substrato enzimático e cromógeno. Esta solução desenvolverá uma cor azul quando a amostra for negativa. A cor azul.

Componentes do kit:

1. MCPL MICROPLACA:

12 x 8 pocinhos recobertos com HAV (humano), inativado com formol. Pocinhos separáveis individualmente.

2. CONJ CONJUGADO:

1 x 11 ml de anti-HAV (monoclonal de camundongo) conjugado com peroxidase. Contém proteínas estabilizantes, mertiolato sódico a 0,01% e sulfato de gentamicina a 0,003%. Pronto para usar.

3. WASH SOLN 10x SOLUÇÃO DE LAVAGEM:

2 x 50 ml de tampão fosfato concentrado (10x) que contém Tween 20 a 1% e mertiolato sódico a 0,01%. Diluir 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar.

4. SUBS BUF TAMPÃO SUBSTRATO:

1 x 14 ml de tampão citrato-acetato contendo peróxido de hidrogênio.

5. SOLN TMB CROMÓGENO:

1 x 1,5 ml de 3,3’, 5,5’-Tetrametilbenzidina (TMB) dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO).

6. CONTROL + CONTROLE POSITIVO:

1 x 0,5 ml de soro humano diluído que contém anticorpos anti-HAV. Contém proteínas estabilizantes, mertiolato sódico a 0,01% e sulfato de gentamicina a 0,003%. Pronto para usar.

7. CONTROL – CONTROLE NEGATIVO:

1 x 0,5 ml de soro humano diluído, negativo para anticorpos anti-HAV. Contém proteínas estabilizantes, mertiolato sódico a 0,01% e sulfato de gentamicina a 0,003%. Pronto para usar.

8. H2SO4 1N SOLUÇÃO DE BLOQUEIO: 1 x 12 ml de ácido sulfúrico 1N. Pronto para usar.

9. SEALS FOLHAS ADESIVAS:

Para cobrir a microplaca durante as incubações.

10. BAG BOLSA DE PLÁSTICO:

Para guardar as tiras não utilizadas.

Material necessário não incluído:

- Água destilada ou deionizada.

- Pipeta multicanal e micropipetas (10 μl, 100 μl, 1000 μl) e ponteiras descartáveis.

- Incubador a 37°C ± 1°C.

- Cronômetro.

- Leitor de microplacas com filtro de 450 nm. Recomendável filtro de referência de 620 ou 630 nm.

- Sistema de lavagem manual ou automático.

Coleta da amostra:

Usar soro fresco ou plasma. Outros anticoagulantes devem ser avaliados antes de ser utilizados. As amostras podem ser conservadas por 3 dias entre 2-8°C. Para guardar por um período de tempo mais longo as amostras devem ser congeladas à -20°C. Evitar congelar e descongelar as amostras repetidamente. Partículas em suspensão devem ser eliminadas por centrifugação. As amostras não devem ser inativadas pelo calor, pois podem produzir-se resultados incorretos. Não se deve utilizar amostras que contenham azida sódica.

Realização do Exame:

1. Utilizar somente o número de tiras necessárias para o teste. Reservar 6 pocinhos para o branco e controles. Usar três pocinhos para o controle negativo e dois para o controle positivo. Transferir 10 μl de cada amostra e de cada controle aos pocinhos correspondentes. Deixar vazio um pocinho para o branco do substrato.

2. Adicionar 100 μl de conjugado a todos os pocinhos da placa, com exceção do pocinho do branco do substrato. Evitar a formação de bolhas. Misturar dando pequenos golpes nos bordos da microplaca.

Obs: Deve-se tomar muito cuidado para não tocar os bordos dos pocinhos com a pipeta nem salpicar o conjugado fora dos pocinhos.

3. Cobrir a placa com uma folha adesiva e incubar durante 1 hora a 37°C.

4. Durante