Insulina Recombinante

Para a produção de insulina humana recombinante em bactérias é necessário fazer uso da chamada técnica do DNA recombinante. A primeira etapa é a preparação do DNA humano contendo o gene codificador para a insulina e do DNA plasmidial a ser utilizado. A molécula de DNA humano pode ser facilmente obtida através da amplificação do gene a partir de um pool de DNA genômico (que pode ser extraído de qualquer tecido humano sadio). Para isso faz-se uso da técnica de amplificação em cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores específicos para o gene e que contenham caldas com as seqüências das enzimas de restrição que serão posteriormente utilizadas. O plasmídeo (também chamado vetor) de expressão a ser utilizado é em geral comercial, e deve ser cuidadosamente escolhido.

Com os DNAs em mãos, a próxima etapa é a digestão das moléculas com as enzimas de restrição apropriadas. Cada enzima irá digerir uma extremidade das moléculas de DNA humano, que já contêm as seqüências apropriadas. O plasmídeo, por sua vez, será aberto e conseqüentemente linearizado com as mesmas duas enzimas que foram utilizadas no DNA humano. É importante a escolha correta das enzimas no sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo, bem como a escolha de qual iniciador conterá seqüência para qual enzima de restrição. Isso permite a clonagem do inserto de forma unidirecional.

Após a digestão dos DNAs, é chegada a hora da ligação do fragmento codificador para a insulina humana no plasmídeo bacteriano. Para isso, as moléculas de DNA (humano e plasmidial) contendo extremidades coesivas que se anelam por pareamento de bases, são colocadas juntas. Para que a ligação do fragmento com o vetor seja permanente, é comum adicionar uma enzima denominada DNA ligase à reação. Como o procedimento não é 100% eficiente, existirão agora tanto plasmídeos recombinantes (contendo o gene da insulina humana) quanto não recombinantes (que acabaram se religando ou não foram eficientemente digeridos), sem o gene da insulina.

Após a ligação do fragmento ao vetor e a conseqüente geração dos plasmídeos recombinantes, é necessário agora a sua inserção em bactérias apropriadas (ditas bactérias competentes). A esse procedimento denomina-se transformação, que pode ser de vários tipos, dentre eles a transformação térmica e elétrica. O processo de transformação funciona com o conceito de que um choque (térmico ou elétrico, nos casos acima) desestabiliza a membrana das bactérias, permitindo assim que os plasmídeos entrem nas células, sem que essas morram. As bactérias são colocadas em meio apropriado contendo o vetor e submetidas ao choque, permitindo assim a entrada dos plasmídeos. As bactérias são então cultivadas em meio enriquecido e depois plaqueadas em meio sólido para a análise das colônias resultantes.

É muito comum o uso de genes marcadores para que as colônias contendo o plasmídeo com o inserto desejado sejam selecionadas para posterior uso. Um dos tipos de marcação é realizado para separar as colônias com ou sem plasmídeos. Para isso, os plasmídeos utilizados em clonagem possuem geralmente um ou mais genes de resistência a antibióticos. Desta maneira, ao plaquearmos as bactérias vivas em um meio sólido podemos selecionar aquelas que são resistentes ao antibiótico (contêm o plasmídeo) daquelas que não são resistentes ao mesmo (não possuem o plasmídeo e, portanto, morrerão). Um segundo tipo de marcação bastante comum é usado para separar