Métodos Para Detecção De Endotoxinas Bacterianas In Vitro

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Métodos para detecção de endotoxinas bacterianas in vitro

Aguimon Junior S. S. I Karajá – 10030007201

Camila Costa dos Santos – 1003000XX01

Mayara Gomes dos Santos – 10030002001

Milena Cristina xxx – 1003000XX01

Wana Lailan Oliveira xxx – 1003000xx01

BELÉM – PARÁ

2014 

INTRODUÇÃO

Nos últimos dez anos, houve um avanço sem precedentes no desenvolvimento da competitividade e, consequentemente, na busca por mais produção e eficiência nas atividades empresariais. Com o fenômeno da globalização observa-se um enorme esforço para o aprimoramento da qualidade dos produtos e processos.

Para assegurar que os produtos farmacêuticos tenham e mantenham os atributos de estrutura, pureza, concentração, potência e inocuidade requeridas para seu uso existe um conjunto de normas e atividades relacionadas denominado Boas Práticas de Fabricação (BPF).

Para estabelecer evidencia documentada, que proporcione com alto grau de segurança, de que determinado procedimento quando executado sob-condições pré-estudadas e definidas seja capaz de reproduzir um serviço ou bem, dentro das especificações e qualidades desejáveis, as BPF recomendam que seja realizada a validação dos processos e das metodologias analíticas.

As endotoxinas são complexos de alto peso molecular, associados à membrana externa de bactérias gram negativas, quando as mesmas são purificadas são denominadas de lipopolissacarideo (LPS).

A parte mais interna da molécula da endotoxina é o lipídeo A que possui atividades biológicas de pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose, alteração da temperatura e gelificação do amebócito de Limulus.

 

Métodos para detecção de endotoxinas bacterianas in vitro

O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado.

Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL.

O reagente LAL é um extrato aquoso dos amebócitos, que são as células sanguíneas da hemolinfa azul da espécie de caranguejo ferradura Limulus polyphemus, composto de enzimas que reagem em presença de pequenas quantidades de endotoxina.

O procedimento mais simples e amplamente usado para detecção de endotoxinas baseia-se na gelificação. Volumes iguais de reagente LAL e da solução à ser analisada são transferidos a tubos de ensaio. A mistura homogeneizada é incubada em banho de água a 37°C por uma hora. O ponto final da reação é facilmente verificado pela remoção dos tubos e inversão a 180º. A presença do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerada positiva para endotoxinas.

O ensaio se constitui em teste limite, levando-se em consideração a sensibilidade do LAL empregado, que varia de 0,25 a 0,015 UE mL-1. (UE = Unidade de Endotoxina)

O método se baseia na reação entre os amebócitos e a endotoxina, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido.

O manual do Food and Drug Administration (FDA), dos Estados Unidos, de 1987 e o Teste para Endotoxinas Bacterianas da USP descrevem recomendações sobre critérios necessários no uso do LAL para a validação de produtos para o uso humano, ou em animais, e equipamentos médicos, em substituição ao ensaio de pirogênio realizado nos coelhos.

Devido à natureza crítica da detecção de endotoxinas pelo LAL em produtos farmacêuticos, o FDA Office of Biologics estabeleceu condições padronizadas para a produção e ajuste da potência de LAL. Desde setembro de 1997, obteve-se a globalização do padrão internacional da endotoxina, e do padrão de referência de endotoxina (PRE), contendo 10.000 unidades internacionais de endotoxina por ampola. Conforme estudos colaborativos envolvendo teste animal e LAL, um nanograma de endotoxina de E.coli 055:B5 é similar em potência a 5 Unidades de

Endotoxina (UE) do PRE da USP. Além disso, quando um LPS é padronizado em UE com um lote específico de LAL e PRE, torna-se um PE (do inglês Control Standard Endotoxin (CSE)), o que permite correlações entre PRE (UE mL-1) e PE

(mg mL-1).

Embora o ponto final de gelificação seja o mais amplamente usado dentre os métodos de LAL, apresenta a desvantagem de impedir a quantificação da endotoxina em níveis abaixo daqueles em que se forma o gel consistente.

Assim, existem outros métodos, entre eles, turbimétrico quantitativo, colorimétrico de proteína, nefelométrico e cromogênico quantitativo que proporcionam informações quantitativas e qualitativas acerca da concentração de endotoxina nas amostras.

Método Turbidimétrico Quantitativo

Este ensaio é baseado no fato de que qualquer aumento na concentração de endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez devido à precipitação de proteína coagulável (coagulogênio) no lisado. Procede-se à leitura da densidade óptica de várias diluições da substância a ser analisada contra curva-padrão e são obtidas medidas quantitativas de endotoxinas, em grande faixa de concentrações. Nesta técnica cinética, mede-se o tempo necessário para se atingir uma absorbância pré-determinada da mistura de reação ou a velocidade de desenvolvimento da turbidez.

Método Colorimétrico de Proteína

Conforme o método de formação do gel, quantidades da amostra e lisado