O NOCAUTE GÊNICO

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NOCAUTE GÊNICO

Elaboração:

Natália Ingrid Pezzoti

Orientação:

Profa. Dra. Eliane Patrícia Cervelatti

Araçatuba

2018

 

 NOCAUTE GÊNICO

Projeto de pesquisa aplicada, do curso de Engenharia de Bioprocessos, referente à disciplina de Engenharia Genética.

Orientadora: Profª Eliane Patrícia Cervelatti.

Centro Universitário Católico Salesiano Auxilium – UNISALESIANO – ARAÇATUBA.

Araçatuba- SP

2018

ÍNDICE

1. Introdução............................................................6
2. Objetivo...............................................................7
3. Metodologia..........................................................7

1. Nocaute.........................................................7

1. Desenvolvimento e Resultados.................................8

4.1. Extração do fragmento de DNA......................................10

4.2. Site de mapeamento genéticos........................................10

4.3. Enzima AvrII........................................................11

4.4. pCU18...............................................................12

4.5. Cultivo em meio de cultura ..........................................13

4.6. Enzimas para as bordas .............................................14

4.7.    Higromicina.........................................................15

4.8. Última enzima (AvrII) ............................................16

4.9 Eletroforese..........................................................17

1. Conclusão...............................................................18
2. Referências Bibliográficas........................................18

1. INTRODUÇÃO

A identificação de sequências de codificação dentro de um genoma e uma análise de produtos gênicos são as próximas fases que levam ao reconhecimento das funções preenchidas pelos genes. A análise da função do gene é uma tarefa para a nova genômica funcional de campo emergente. Existem numerosos métodos para caracterizar as funções dos genes e seu número está aumentando constantemente devido ao progresso mais rápido e rápido da tecnologia e da informatização. O processo de determinação da função de um gene estudado só é possível após a obtenção da sequência e identificação de onde ela é expressa. [1]

É realizado por meio de análises computacionais ou estudos experimentais, associando um gene e um fenótipo relacionado. Várias estratégias e técnicas de pesquisa, tais como predição baseada em homologia, aumento da expressão ou inativação gênica (nocaute) têm sido usadas há muitos anos. O acesso comum às sequências do genoma, que são armazenadas em bancos de dados, permite uma comparação com as sequências estudadas. Uma análise que mostra a similaridade com os genes reconhecidos é útil na determinação inicial de um provável produto gênico e sua função.[1]

O método de previsão através da homologia baseia-se no pressuposto de que, se um gene recém-sequenciado é muito semelhante a um gene já caracterizado e publicado, a função do novo gene é provavelmente semelhante. Neste método, o primeiro passo é comparar o fragmento de DNA estudado com os fragmentos de DNA de organismos modelo disponíveis nas bases de dados de computador. O ADN da maioria dos organismos modelo foi completamente sequenciado e pelo menos parcialmente caracterizado em relação à função do gene. Os maiores e mais populares bancos de dados, nas quais sequências completas de genomas foram armazenadas, estão no servidor do NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia). O requisito para o conhecimento das funções dos genes e o desenvolvimento de tecnologias de bioinformática tem levado muitas instituições científicas a se envolverem na catalogação de conhecimento de homólogos conhecidos em bancos de dados. [1]

Com a técnica de "nocaute", hoje é possível alterar o funcionamento de praticamente qualquer gene desde os primeiros estágios embrionários dos animais de laboratório que servem de modelo para entender as principais doenças humanas, como os problemas cardíacos, o mal de Alzheimer e vários tipos de câncer.[1]

1. OBJETIVO

 De forma didática demonstrar todo o processo de um nocaute gênico, tais como pesquisas, escolhas de enzimas, elaboração e desenvolvimento. Sendo uma forma de colocar em pratica os conhecimentos adquiridos em sala de aula.

1. METODOLOGIA

1.  NOCAUTE

Nocaute ou inativação de gênica é uma técnica genética na qual um dos genes de um organismo é inoperante ("eliminado" do organismo). Os nocautes são usados ​​para estudar a função dos genes, geralmente investigando o efeito da perda gênica.

Com isso permite uma comparação do fenótipo obtido do organismo estudado com o fenótipo do organismo não mutado. Com base nisso, podemos determinar quais mudanças ocorreram em um organismo e atribuí-las ao gene não ativo. Um princípio básico desta técnica é gerar e introduzir uma construção genética em um organismo que efetivamente bloqueie um gene específico.

O efeito é a falta de síntese da proteína codificada pelo gene silenciado, que frequentemente resulta em diferenças fenotípicas que podem levar a uma conclusão sobre a função de um dado gene. Uma das técnicas mais comuns de inativação gênica é a sua descontinuação por meio de um fragmento de DNA introduzido artificialmente através da mutagênese insercional (knock-out), que é baseada na recombinação homológica.

A mutagênese de inserção baseia-se em uma inserção do fragmento de DNA de um vetor dentro do gene localizado em um cromossomo. O DNA cromossômico assim obtido contém o gene descontinuado, que não sofre expressão e, com efeito, não há proteína criada. Os distúrbios causados ​​pela falta de proteínas mostram sua função no organismo. O knock-out de genes permite rastrear alterações fenotípicas resultantes da troca de fragmentos de sequência entre o DNA cromossômico e o vetor. O vetor geralmente contém um gene descontinuado por um marcador seletivo permitindo uma identificação de recombinantes e ao mesmo tempo causando uma interrupção do gene e tornando-o inativo. A diferenciação entre células mutadas e não mutadas nem sempre é possível apenas com base em alterações fenotípicas, que podem ser inequívocas.