RELATÓRIO EXTRAÇÃO DNA

UNIVERSIDADE DO VALE DO TAQUARI - UNIVATES

CURSO DE MEDICINA

RELATÓRIO DA PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DE DNA

ALÉXIA RAFAELA RENZ, ENZO VINICIUS SOUZA SANTANA, JULIA TAMBARA LEITE

Data: 31/08/2017

INTRODUÇÃO

        Uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste em duas longas cadeias polipeptídicas, compostas por quatro tipos de subunidades nucleotídicas, denominadas como cadeia de DNA ou fita de DNA. As ligações de hidrogênio entre as bases dos nucleotídeos mantêm as duas cadeias unidas. Os nucleotídeos são compostos de açúcares com cinco carbonos, aos quais um ou mais grupos fosfato estão ligados, e uma base contendo nitrogênio. No caso dos nucleotídeos do DNA, o açúcar é uma desoxirribose ligada a um único grupo fosfato. A base pode ser adenina (A), citosina (C), guanina (G) ou timina (T).

        Segundo Bartlett (apud GOUVEIA; REGITANO, 2007, p. 3), a extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é o primeiro passo para a realização da maioria das metodologias de biologia molecular. Pode ser obtido DNA a partir de inúmeros tipos de tecidos e células. Existe uma infinidade de protocolos para realização de tal procedimento. A escolha do protocolo de extração de DNA dependerá de diversos fatores como: tipo de tecido a ser utilizado, grau de pureza e de integridade necessária para a aplicação em que o DNA será utilizado (PCR, sequenciamento, clonagem gênica, etc.).

A extração de DNA, sendo assim, é importante para a execução de análises de expressão gênica, bem como para a análise de proteínas que futuramente serão formadas. Para que se obtenham resultados desejáveis é necessário que as sequências de DNA estejam puras e em sua forma mais íntegra possível, pois moléculas fragmentadas originam dados de baixa qualidade e pouco confiáveis.

OBJETIVO 

Relatar como foi realizado o procedimento de extração do DNA de sangue humano.

        

        

DESENVOLVIMENTO

A aula prática tinha por objetivo realizar a extração do DNA de sangue humano. Para tanto, foi utilizado o protocolo adaptado de Lahiri e Nurnberger (1991), denominado: A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Sendo utilizada amostra de sangue periférico humano com anticoagulante (EDTA). Seguiram-se os passos abaixo:

        

• Primeira etapa: LISE DAS MEMBRANAS

        Nessa etapa, fez-se uso do microtubo (eppendorf), no qual se adicionou a amostra de sangue (±450μL) e em seguida o NONIDET p-40 (20 μL). Logo após, foi adicionado 500 μL de TKM1 e utilizou-se o vórtex para deixar a mistura homogênea, depois o tubo foi levado para a centrifugação.

        No procedimento em questão ocorreu a lise das hemácias, provocando a liberação de proteínas (hemoglobina).

        

• Segunda etapa: PURIFICAÇÃO

        Após a centrifugação (4000 rpm por 10 min) foi formado um pellet – que se depositou no fundo do tubo – e um sobrenadante que foi descartado. Então novamente foi adicionado mais 400 μL TKM1 ao tubo com o pellet e este foi agitado até sua dissolução. Depois foi realizada uma nova centrifugação com o posterior descarte do sobrenadante. Sendo esse passo repetido por outras duas vezes. Com esse procedimento foi feita a remoção dos componentes lipídicos restantes das hemácias.  

        Logo após, foi adicionado 64 μL de TKM2 e o tubo foi agitado no vórtex para que o pellet voltasse a ficar suspenso. Depois foi colocado 4 μL de SDS 10%, para que ocorresse a lise dos glóbulos brancos e o tubo foi agitado manualmente e colocado em banho-maria por 10 minutos a 55ºC, previamente aquecido.

        Por último foi adicionado 24 μL de cloreto de sódio 6M e o tubo foi centrifugado (4500 rpm por 10 minutos) para que houvesse a formação de um sobrenadante (agora contendo o DNA) e um pellet de proteínas que foi descartado. O DNA foi transferido com uma pipeta para um novo microtubo.

 

• Terceira etapa: PRECIPITAÇÃO DO DNA

        Nessa etapa foi realizada a adição de dois volumes de etanol absoluto (aproximadamente 220 μL) no novo microtubo, ele foi agitado até acarretar a precipitação, formando uma “nuvem” de DNA. Após isso o microtubo foi centrifugado (10.000 rpm por 10 min.), fazendo com que o DNA ficasse aderido ao fundo e o sobrenadante pudesse ser desprezado.

• Quarta etapa: REIDRATAÇÃO DO DNA

        Por fim, foi adicionado ao DNA o solvente TE (100 μL), que serve como um tampão de conservação e o microtubo levado para a geladeira para o seu armazenamento.

RESULTADOS

        O procedimento para obtenção da amostra de DNA foi realizado com sucesso por todos os integrantes do grupo, sendo posteriormente feita a quantificação do DNA com Espectrofotômetro A260. Para a leitura foi utilizada 499 μL de H2O e 1μL da amostra de DNA. A absorbância se deu nos comprimentos de 260 nm e 280 nm. Após a obtenção dos valores da leitura foi realizado o cálculo para determinar a concentração de DNA na amostra. O cálculo ocorre a partir da seguinte equação:

DNA [ ] μg/μL = OD260 x F.D x 50 (μg/mL)

1000

A mesma foi simplificada e aplicada por: OD 260x 25 e os resultados obtidos por cada integrante do grupo foram:

	ABSORBÂNCIA	MÉDIA
ALÉXIA	0,043	0,6875
0,012
ENZO	0,040	0,5625
0,005
JULIA	0,015	0,2625
0,006

Na análise do resultado obtido, pode-se calcular a pureza, no qual se divide os valores obtidos no espectrofotômetro para os comprimentos de onda de 260nm (numerador) e 280nm (denominador) um pelo outro. O valor ideal para a concentração de DNA deve estar entre 1,6 e 2. Valores maiores indicam contaminação proteica e valores menores indicam contaminação com álcool.