DOSAGEM DE PROTEÍNAS (AULA PRATICA)

DOSAGEM DE PROTEÍNAS (AULA PRATICA)

O aparelho utilizado para avaliar a coloração chama-se fotocolorímetro e possui uma fonte de luz branca que é direcionada para a solução. A quantidade de luz absorvida pela solução é medida por uma célula foto-elétrica, transformada em uma corrente elétrica e medida em um galvanômetro. A faixa de leitura em que os valores de absorção (ou extinção) são correspondentes à concentração das soluções situa-se entre 0,15 e 0,6.

A fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolver a medida de intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico  em solução. Ou seja, analisa a  absorvência ( capacidade que tem uma solução de absorver uma certa quantidade  de energia  de luz incidente )

O biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de potássio (KOH) e sulfato de cobre II (CuSO4), junto com tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6 4H2O). este reagente de coloração azul, torna-se violeta na presença de proteínas ( o reagente de biureto torna-se violeta ao reagir com íons cúpricos) A intensidade da coloração violeta varia de acordo com a concentração de proteínas na amostra analisada.

O objetivo desse trabalho é conhecer os métodos fotocolorimetricos e construir uma curva padrão para uma solução de proteína com concentração conhecida, além de determinar a quantitativamente a concentração de proteínas em amostrar biológicas.

Preparar a curva padrão da albumina bovina pipetando os seguintes valores:

TUBOS	B	1	2	3	4
Água (mL)	5,0	4,0	3,0	2,0	1,0
Padrão de proteína (5mg/mL)	0,0	1,0	2,0	3,0	4,0
Reagente de Biureto (mL)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
TOTAL	10,0	10,0	10,0	10,0	10,0
COLORAÇÃO	Azul claro	Violeta claro	Violeta médio	Violeta mais forte	Violeta escuro

Preparar cada amostra para analise conforme:

TUBOS	Am 1	Am 2	Am 3
Amostra (? Mg/mL de proteína)	5,0	5,0	5,0
Reagente de Biureto (mL)	5,0	5,0	5,0
TOTAL	10,0	10,0	10,0
COLORAÇÃO	Violeta mais claro	Violeta claro	Violeta médio

Incubar os tubos por 10 minutos a 30ºC

Transferir a solução do tubo branco para uma cubeta de quartzo

Colocar a cubeta no fotocolorimetro e regular o galvanômetro em zero utilizando o filtro de 540 nm (verde)

Realizar a leitura da absorção ou extinção nos tubos da curva e nas amostras, anotando os valores obtidos e organizando conforme a tabela abaixo:

TUBOS	Concentração de Proteína # (C )	Extinção (D0)
B	0	0
1	0,5	0,07
2	1,0	0,11
3	1,5	0,19
4	2,0	0,27
Am 1		0,08
Am 2		0,01
Am 3		0,04

# A concentração de proteína deve ser calculada em função da diluição realizada

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