Novo Projeto

ANÁLISE DE RNA

Introdução

O RNA total é utilizado em diversos tipos de análises de expressão gênica e caracterização de transcritos, baseado nos métodos de Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA, ESTs, etc. citando apenas os mais comuns. Para essas análises é recomendável a purificação de moléculas de RNA que estejam mais intactas e mais completas em termos de comprimento, de forma mais pura e íntegra possível. Diversos métodos foram descritos e aplicados para extração de RNA total, baseados na utilização de agentes desnaturantes fortes, tais como fenol e sais de guanidina. A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.). A utilização de agentes desnaturantes fortes permitem a lise das células e a inativação das ribonucleases. O método básico emprega a extração com fenol seguida da precipitação do RNA por etanol. De forma a diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes é recomendável tratá-los com autoclavagem e/ou com DEPC (dietilpirocarbonato). DEPC é um forte inibidor de RNAses. Os passos básicos da extração de RNA consistem:

1. Trituração dos tecidos por moagem sob baixa temperatura (N líquido);

2. Liberação dos componentes celulares no tampão de moagem (extração) por lise das membranas com detergentes;

3. Inativação das nucleases por agentes químicos e desnaturação das proteínas com fenol e clorofórmio;

4. Remoção dos restos celulares e precipitação das proteínas desnaturadas por centrifugação. Recuperação dos ácidos nucleicos por precipitação com etanol;

5. Fracionamento do DNA e RNA por solubilização diferencial sob alta concentração de sal. Vários métodos empregam a precipitação seletiva usando cloreto de lítio (LiCl).

TRIZOL

O produto comercial TRIZOL (Invitrogen) consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos. O reagente consiste numa solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato, que deriva da melhoria do método de isolamento de RNA num único passo desenvolvido por Chomczynski & Sacchi (1987. Anal. Biochem 162, 156). Durante a homogenização ou lise da amostra, o TRIZOL mantém a integridade do RNA enquanto rompe as células e dissolve os componentes celulares. A adição do clorofórmio, seguido da centrifugação, separa a solução em fases aquosa e orgânica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. Depois da transferência da fase aquosa para um novo tubo, o RNA total é recuperado por precipitação com isopropanol. Depois da remoção de fase aquosa, o DNA e as proteínas da amostra ainda podem ser recuperados por precipitação seqüencial. A precipitação com etanol resulta em DNA na interface e uma precipitação adicional com isopropanol produz proteínas a partir da fase orgânica. A co-purificação do DNA pode ser útil na normalização da produção de RNA entre amostras.

Essa técnica apresenta bons resultados com pequenas quantidades de tecido (50 a 100 mg de tecido) e células (5 x 106) ou até grande quantidades de tecidos (>1 g) e células (>107) de origem humana, animal, plantas ou bacteriana. O procedimento de extração pode ser realizado em menos de 1 hora e um grande número de amostras podem ser preparadas. O RNA total produzido é livre de contaminações por DNA ou proteínas.

Preparo de material livre de RNAse:

As ribonucleases são de difícil controle. O único método possível é evitar a sua presença nos reagentes, vidrarias e materiais, evitando a subsequente contaminação. Durante a manipulação das amostras e soluções, deve-se sempre usar luvas de látex descartáveis. Devem ser usadas boas práticas de microbiologia. Os materiais plásticos devem ser descartáveis e pipetadores automáticos devem ser dedicados a manipulação de RNA para evitar contaminação cruzada com RNAses (empregadas no isolamento de DNA ). Os cadinhos e pistilos deve ser lavados com uma solução de 0,01 % SDS (p/v), e enxagüados com água, água destilada e água ultrapura (milliQ). A seguir, os cadinhos e pistilos são incubados com água tratada com 0,01% de dietilpirocarbonato (DEPC) ativo por duas horas na capela e secos, antes de serem embalados com papel alumínio, autoclavados (120C) por 20 minutos e secos na estufa (80C). Todas as soluções usadas para trabalhos com RNA devem ser preparadas com água 0,01% DEPC autoclavada. As cubas de eletroforese e pentes para RNA devem ser lavadas com 0,01% SDS e enxaguadas com água livre de RNAse. A vidraria também é lavada da mesma forma e depois autoclavada.

Na presença de TRIZOL o RNA está protegido contra ribonucleases. Após a precipitação e lavagem, é recomendável que os tubos e plásticos estejam livres de RNAse para evitar a degradação. Uma outra possibilidade de tratamento das vidrarias pode ser a 150ºC por 4 h e os ítens plásticos tratados por 10 min com 0,5 M NaOH, lavados completamente com água e autoclavados.

OBS. O DEPC deve ser manuseado com cuidado, usando luvas, máscara e manipulado em capela sempre que possível, pois é inflamável e mutagênico. Como o DEPC reage com aminas, não pode ser usado para tratar soluções contendo tampão Tris, nem no tratamento de solventes orgânicos, deve-se obrigatoriamente separar um frasco de reagente para o perparo exclusivo de soluções a serem utilizadas para a extração de RNA.

Extração de RNA total (método do Trizol)

Reagentes necessários:

- clorofórmio

- isopropanol

- etanol 75% em água tratada com DEPC

- água livre de RNAse ou solução de 0,5% de SDS. [Para preparar água livre de RNAses, coloque água em garrafas livre de RNAses. Adicione dietilpirocarbonato (DEPC) até 0,01% v/v. Deixe por toda noite e autoclave. A solução de SDS deve ser preparad com água autoclavada tratada com DEPC]

O método básico recomendado de extração de RNA usando Trizol (Invitrogen Life Technologies), utiliza 100 mg de tecido fresco pulverizado em cadinhos com nitrogênio líquido. Antes de descongelar, o macerado recebe 1 mL de reagente Trizol sendo então transferido para microtubo (1,7 mL), e vortexado. A proporção deve ser