Relatório 14 - Bioquímica de Alimentos

Universidade Estadual de Campinas[pic 1][pic 2]

Faculdade de Engenharia de Alimentos

Departamento de Ciência de Alimentos

 

Isolamento de microorganismos produtores de enzimas amilolíticas e produção de enzima invertase de Aspergillus niger por fermentação semi-sólida

TA610  - Transformações Bioquímicas em Alimentos

Professora: Hélia Harumi Sato

Alunas:

Fernanda Annetta RA:116823

Fabiana Jacon RA:116728

Juliana Albernaz RA: 121062

Luciane Zanatta RA: 119791

Grupo 7

Campinas, 2014  

1. INTRODUÇÃO

A invertase é responsável pela hidrólise da sacarose  na formação de açúcar invertido e é utilizada em indústrias alimentícias e farmacêuticas

As enzimas são proteínas de enorme importância e interesse comercial, que podem ser obtidas de animais, vegetais ou microrganismos, sendo que estes últimos representam uma facilidade enorme na obtenção, inclusive diminuindo custos de produção. No caso dos microrganismos, a aprodução pode ser feita através de fermentação submersa ou em meio sólido (FSS). A FSS é mais adequada quando são utilizados fungos filamentosos, pois opera em condições drásticas de atividade de água (RUSTIGUEL, 2009).

No caso da invertase, os fungos filamentosos e leveduras são as fontes mais consideráveis, sendo que dentro do reino, as espécies mais utilizadas são Aspergillus niger (fungo filamentoso) e Saccharomyces cerevisie (levedura). A produção de invertase apresenta particularidades, de acordo com o microrganismo usado, e consequentemente, a enzima produzida apresenta características bioquímicas distintas. As enzimas produzidas podem ser intra ou extracelulares, sendo que no primeiro caso, é obrigatório promover a lise celular para que se obtenha a enzima, e no segundo, uma breve “lavagem” seguida de filtração é suficiente para obter o extrato enzimático (RUSTIGUEL, 2009).

A invertase obtida de Aspergillus niger AS0023, a temperatura ótima é de 55°C e o pH = 4. Já para a invertase obtida de Aspergillus niger IMI 303386, a temperatura ótima é 50°C e o pH = 6,5 (RUSTIGUEL, 2009).

A invertase é muito aplicada na indústria pois a frutose é muito mais atrativa que a sacarose, pois não apresenta-se sob a forma cristalizada, a qual pode representar problemas em alguns processos. É muito aplicada em processos de confeitaria; na obtenção da frutose usada com alternativa de adoçante para os diabéticos; na produção de etanol, hidrolisando a sacarose em açúcares redutores que servem de substrato para as leveduras; produção de frutooligossacarídeos (FOS), que não são absorvidos pelo organismo, apresentando características prebióticas. E muito comumente usada para produzir o açúcar invertido, que é aplicado em balas, chocolates, entre outros, principalmente por não cristalizar (RUSTIGUEL, 2009).

Embora a invertase de  Aspergillus niger tem um potencial enzimático enorme, sendo que suas linhagens são capazes de produzir até 19 tipos de enzimas, dependendo das condições do meio a que são submetido. As mais importantes enzimas por ele produzidas são: Lipase, glicoamilase (amilases em geral), glucose-oxidase, celulase, pectinase, entre outras (ROVEDA, 2007).

1. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

• Placa de Petri contendo agar nutriente com 0,5% de amido
• Tubo de ensaio contendo 10mL de água destilada esterilizada
• Amostra de terra
• Placa de Petri contendo agar nutriente com 0,5% de amilopectina
• Tubo de cultura da linhagem A (Flavobacterium sp)
• Placa de Petri contendo agar nutriente com 4% de sacarose
• Tubo de ensaio contendo caldo de cana
• Microorganismo: Aspergillus niger cultivado em tubo inclinado de agar batata
• Meio de cultivo: frasco de erlenmeyer contendo 20g de meio de farelo de trigo
• Reagentes para o método de Somogyi-Nelson (SNI e SNII)

Métodos

PARTE A

I: Isolamento de microorganismos produtores de enzimas amilolíticas de amostra de terra

1. Adicionou-se aproximadamente 1 colher pequena cheia de terra em um tubo contendo 10mL de água esterilizada. Agitou-se e foi deixado em repouso por 5 minutos.
2. Inoculou-se com alça o líquido sobrenadante, por esgotamento, em placa de Petri contendo agar nutriente + 0,5% de amido.
3. Incubou-se a placa a 30°C por 24 horas.

II - Ilustração da produção de enzimas amilolíticas desramificantes por microorganismos

1. Repicou-se , assepticamente, a linhagem A na placa contendo agar nutriente + 0,5% de amilopectina.
2. Incubou-se a placa a 27-28°C por 48 horas.

PARTE B - Isolamento de microorganismos produtores de goma

1. Inoculou-se com alça a amostra de caldo de cana, por esgotamento, em placa de Petri contendo agar nutriente + 4% de sacarose.
2. Incubou-se a placa a 30°C por 24 horas.

PARTE C

I - Produção de invertase de Aspergillus niger por fermentação semi-sólida

1. Inoculou-se assepticamente com alça de níquel cromo a linhagem de fungo no meio de farelo de trigo e agitou-se o frasco no sentido horizontal para espalhar o inoculo.
2. Incubou-se o frasco erlenmeyer na estufa a 30°C por 7 dias.

II - Extração da enzima

1. Acrescentou-se 50mL de água destilada ao meio de farelo de trigo inoculado com o fungo Aspergillus niger.
2. Triturou-se com bastão de vidro até que o meio apresente-se desintegrado.
3. O frasco foi colocado em agitador rotatório por 15 minutos para a extração da enzima.
4. Filtrou-se em papel de filtro (o extrato obtido é denominado extrato enzimático bruto).
5. Diluiu-se o extrato nas diluições 1:5, 1:12, 1:20 e 1:40 para determinar a atividade de invertase.
6. Pipetou-se 4mL de solução de sacarose na concentração de 10mg/mL em tampão acetato 0,05mol/L pH 5,6 em 5 tubos de ensaio identificados com as diluições.
7. Incubou-se por 10 minutos em banho-maria a 40°C para equilibrar a temperatura.
8. Foi adicionado 1mL das amostras diluídas de extrato bruto em cada tubo de ensaio. No tubo branco foi adicionado 1mL de água destilada.
9. Agitou-se os tubos e deixar incubando por 20 minutos. Após a incubação, foram colocados em banho de gelo para paralisar a reação.
10. Determinou-se a concentração de açúcar redutor formado pelo método de Somogyi-Nelson:
11. Pipetou-se  0,5mL de amostra + 1mL de reagente SNI em tubos de ensaio identificados
12. Os tubos foram agitados e colocados em banho-maria em ebulição por 6 minutos.
13. Posteriormente os tubos foram retirados e colocados em banho de gelo.
14. Os tubos foram retirados do banho de gelo e adicionou-se 1mL do reagente SNII. Agitou-se e foram colocados em repouso por 5 minutos.
15. Calibrou-se o espectrofotômetro com a solução do tubo branco e mediu-se a absorbância das amostras a 540nm.

1. RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Resultados

1. Parte A – Avaliação da produção de enzimas amillíticas desramificantes por microrganismos

A placa à qual foi inoculada a amostra de solo (por esgotamento, em meio nutriente contendo amido), depois de ser incubada recebeu uma quantidade de solução Iodo-KI. Com essa operação, observou-se a formação de um halo transparente em torno do crescimento microbiano, quando a placa foi olhada na luz.

O mesmo processo (adição de Iodo-KI) foi feito com a placa na qual foi inoculada Flavobacterium sp. (letra desenhada em meio nutriente contendo amilopectina). Porém, nesse caso, quando olhado contra a luz, observou-se que os halos estavam azuis (escuros).