A CROMATOGRAFIA EM COLUNA

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2015

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2015

1. INTRODUÇÃO

Cromatografia é um método físico-químico de separação, análise e identificação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes em duas fases: a fase móvel e a fase estacionária. Esta separação depende da diferença entre o comportamento dos analitos com a fase móvel e a fase estacionária. A amostra é adsorvida na fase estacionária e a fase móvel serve como um solvente para a amostra, ajudando-a a eluir através da coluna cromatográfica. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.  As substâncias são identificadas pela ordem com que eluem e pelo tempo de retenção na coluna.

A resolução de uma coluna cromatográfica diz respeito à sua capacidade de separar satisfatoriamente os picos de um cromatograma. Uma boa resolução da coluna depende do tipo eluente utilizado na fase móvel, da fase estacionária, da altura da coluna, do fluxo do eluente na coluna, da temperatura, entre outros fatores.

A cromatografia em coluna é muito usada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente seco ou suspendido no próprio eluente. A substância a ser analisada é colocada na coluna pela parte superior e o eluente vem logo após, em quantidade suficiente para que aconteça a separação. Quando a amostra possui cor, podem-se visualizar as diferentes zonas coloridas descendo pela coluna, que são recolhidas separadamente. Quando a amostra não possui cor, recolhem-se várias frações iguais de eluente, testando-as quanto à presença de substâncias dissolvidas através do uso de reveladores.

1. Cromatografia líquida clássica

Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas.

As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida - fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição -.

A principal etapa ao se utilizar essa técnica é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. Após o empacotamento, é conveniente que se passe uma quantidade do eluente a ser utilizado através da coluna antes da introdução da amostra. Tendo a amostra adsorvida na fase estacionária, o eluente é então adicionado. O eluente pode ser alterado durante o processo cromatográfico. Se, por exemplo, a amostra é constituída por duas substâncias, uma apolar e outra polar, utilizam-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar.

1. Cromatografia líquida de alta eficiência

Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.

O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas reduzidas, responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência.

As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos. A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade. As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.

O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros.

1. Cromatografia gasosa de alta resolução

A cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas, devido à possibilidade de detecção em escalas menores. Além de possuir um alto poder de resolução. A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente.

O principal mecanismo de separação da cromatografia gasosa está baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. As colunas da cromatografia gasosa de alta resolução são maiores em comprimento, menores em diâmetro, possuem a fase líquida como um filme aplicado diretamente às paredes do tubo da coluna e são mais eficientes, quando comparadas às colunas da cromatografia gasosa.

A escolha da fase estacionária é de fundamental importância, que podem ser polares, apolares ou quirais. Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em relação à fase estacionária, os mais usados são hidrogênio, nitrogênio e hélio.

Os detectores de maior aplicação são o detector por ionização em chama e o detector de condutividade térmica.

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1. OBJETIVOS

1. Objetivo geral

Separar os componentes da mistura, analisando o comportamento da fase estacionária e da fase móvel em função das suas polaridades e forças intermoleculares. Discutir sobre as velocidades de eluição dos componentes desta mistura e concluir quais motivos levaram ao resultado obtido.

1. Objetivos específicos

Separar os componentes da mistura;

Analisar o comportamento da fase estacionária e da fase móvel;

Discutir os motivos das diferentes velocidades de eluição dos componentes da mistura.

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1. MATERIAIS E MÉTODOS

1. Materiais

• Coluna cromatográfica
• Suporte universal
• Garra
• Conta gotas
• Bastão de vidro
• Béquer
• Pipeta de Pasteur
• Etanol
• Alaranjado de metila
• Azul de metileno
• Sílica Gel
• Acido acético

1. Metodologia

1. Empacotamento da coluna

Pesou-se 5g de sílica gel em um béquer, adicionou-se etanol e agitou-se com um bastão de vidro. Depositou-se um chumaço algodão na extremidade inferior da coluna cromatográfica, a fim de impedir a passagem de partículas da fase estacionária. Transferiu-se então a solução pastosa para a coluna cromatográfica aos poucos e adicionou-se etanol logo após. Controlou-se o nível de etanol na coluna para que ficasse aproximadamente 0,5cm acima do nível da fase estacionária.