Purificação de um extrato protéico

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AULA PRÁTICA: CINÉTICA ENZIMÁTICA

CURSO DE BIOQUÍMICA

BIOMEDICINA 53

Prof. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva

                                                                                                         Bernardo Chamun

                                                                                                     Mariana Garcia

                                                                                                  Marília Fortes

                                                                                                       Raquel Credidio

SÃO PAULO

2019

Resumo

O objetivo deste experimento é estudar a cinética enzimática da enzima tripsina sob diferentes concentrações do substrato BAPA (Benzoil-arginil-p-nitroanilida) a fim de obter a constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade enzimática máxima (Vmáx) da tripsina para o substrato.

As etapas do procedimento consistem na preparação para reação enzima-substrato, analisadas sob um intervalo de tempo (30min) e após isso, por meio da espectrofotometria, obter a concentração de produto gerado.

Materiais  

• 200 µl de solução de tripsina 1,5 mg/ml em HCl 1 mM em gelo (tripsina);
• Solução de BAPA 1,0 mM; 1,5 mM; 2,0 mM; 2,5 mM; 3,0 mM; 5,0 mM e 10,0 mM ;
• Tampão Tris/HCl 50 mM pH=8,0 contendo 0, 02% CaCl2 (tampão);
• Solução salina de NaCl 0,15 M (solução salina);
• Ácido acético 30% (HAc)  
• Espectrofotômetro UV-vis;
• Cubeta de vidro;
• Pipetas automáticas;  
• Ponteiras de pipeta automática;
• Tubos de ensaio.

Introdução teórica

Uma enzima é uma substância orgânica, normalmente proteica, que atua como catalisador de uma reação, sem ser consumida, abaixando sua energia de ativação e com seletividade catalítica predeterminada: podendo ser altamente seletiva ou de amplo espectro reacional. O mecanismo de funcionamento enzimático se dá essencialmente por meio da sua conformação tridimensional (que a nível cinético aumenta as colisões reacionais efetivas e facilita a formação do complexo ativado) e das alterações químicas realizadas no substrato pelas cadeias laterais dos resíduos e/ou cofatores enzimáticos.  Apesar de serem fundamentais para o funcionamento do corpo, a atividade enzimática está condicionada à fatores como temperatura, pH e concentração do substrato. Como a temperatura humana não varia em condições de homeostasia, os fatores que podem usados para o controle da demanda metabólica dos produtos enzimáticos são o pH e a concentração do substrato.

Neste experimento, é utilizada a tripsina a qual é uma endopeptidase (quebra ligação peptídica no meio da cadeia) e  tem especificidade para a lisina e a arginina, clivando a porção carboxi-terminal de resíduos desses aminoácidos. Também, pertence a classe das serino-proteases, isto é, uma protease que possui em resíduo de serina importante para agir como nucleófilo e atacar o C da carbonila da ligação peptídica.

O funcionamento dessa enzima é otimizado em pH=8, por isso utilizado o tampão Tris/HCl que mantém esse valor no meio reacional. A adição da solução salina (NaCl 0,15M) tem como finalidade equalizar os volumes nos tubos de ensaio e a adição de ácido acético é para interromper as reações visto que com essa adição, o pH do meio irá mudar, alterando sua conformação e, portanto, seu funcionamento.

No experimento, a reação ocorrerá entre a tripsina e o BAPA na qual a tripsina irá hidrolisar a ligação peptídica entre resíduo de Arginina e o anel aromático do BAPA, gerando assim p-nitroanilina e Benzoil-Larginina, como indicado na reação abaixo:

 

 

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Para se monitorar reações enzimáticas, será feito o  acompanhamento da produção de produto, devido a característica físico-química da p-nitroanilina de possuir coloração e absorver luz na faixa do UV-Vis, característica que permitirá ver sua concentração gerada nos tubos de ensaio por espectrofotometria já que essa molécula possui um grupo aromático em sua estrutura e os grupamento aromáticos são ótimos para absorver luz na faixa do  UV-Vis.

Questionário:

1. Qual é o significado do Km?

A constante de Michaelis-Menten (Km) analisa a afinidade da enzima ao substrato que ela está reagindo, sendo que a afinidade entre ambos será inversamente proporcional, ou seja, quanto maior a Km menor é a afinidade entre enzima e substrato e vice-versa.

 

1. O que é turn over?

Turn over é número que indica quantas vezes a enzima completa o ciclo da reação em um segundo, indicando a eficácia do processo de ação da enzima.

Esse número é obtido pela divisão entre o número de moles de substratos catalisados em um segundo e o número de moles de enzima.

 

1. Qual é o significado fisiológico da compartimentalização das enzimas?

A compartimentalização das enzimas é importante para que haja garantia de que elas se manterão nos lugares de atuação, podendo facilmente encontrar o seu substrato e agir da melhor forma pois estará em suas melhores condições fisiológicas (como temperatura e pH). Além disso, evita a sua ação em outros lugares que, consequentemente, seriam danificados.

Procedimento experimental

Foram nomeados sete tubos de ensaio de A a G, todos em duplicata e, com o auxílio da pipeta volumétrica, pipetou-se certas quantidades de tampão e salina em cada um desses tubos conforme valores fornecidos pela tabela abaixo. O tampão foi adicionado para manter o pH 8 constante nos tubos e, assim, evitar a desnaturação das proteínas; e a salina, para completar o volume. Além disso, confeccionou-se um tubo de ensaio sem tripsina, para funcionar como branco (Br), para assim serem feitos os devidos descontos de absorção dos demais constituintes da reação (tampão, solução salina, BAPA, HAc) na absorbância registrada no espectrofotômetro na fase experimental seguinte..