Coloração De Gram

Introdução

Coloração de Gram é uma técnica de coloração para diferenciação de microrganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram.

Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas. Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

Os resultados após a coloração de Gram permitem classificar as bactérias em dois grupos:

Bactérias gram-positivas Bactérias gram-negativas.

Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo iodo-pararosanilina, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante safranina colore novamente as estruturas que foram descoradas.

As bactérias Gram-positivas, que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano - peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante, permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (roxo). Já as bactérias Gram-negativas com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de reter o violeta de Genciana, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).

São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com relação à espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.

Esta coloração permite distinguir os mais variados tipos de bactérias e que tipo de parede celular elas tem (se mais simples ou mais complexas, com mais ou menos peptideoglicanos – principal componente da parede celular bacteriana). As bactérias que descorarem quando submetidas à um solvente orgânico são Gram-negativas, e as que permanecerem coradas mesmo quando em contato com o solvente são denominadas Gram-positivas.

Estas bactérias de diferentes colorações têm também graus diferentes de virulência. As Gram-negativas, por exemplo, são constituídas por uma endotoxina denominada LPS (lipopolissacarídeo), que é causadora da patogenicidade. Já as Gram-positivas possuem a exotoxina rica em ácido lipoprotéico que confere aderência à bactéria.

Bactérias Gram-negativas

As proteobactérias compôem a maior parte das bactérias gram negativas. As principais são:

• Escherichia coli

• Salmonella

• Shigella

Enterobacteriaceae:

• Pseudomonas

• Moraxella

• Helicobacter

• Stenotrophomonas

• Bdellovibrio

• Legionella

Entre outras, como Chlorobi, Chloroflexi, Cianobactérias, Espiroquetas, etc.

Bactérias Gram-positivas

• Filo Firmicutes (Bacilos, Estreptococos, Estafilococos, Enterococos, Actinobacteteria, Listeria, etc).

Objetivo

Esta prática tem como objetivo demonstrar a importância da coloração e diferenciar as bactérias de acordo com a cor obtida após o processo estabelecer a distinção entre:

- Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

Desenvolver também, a habilidades de utilização de microscópio óptico, observando as bactérias depois da coloração de Gram.

 

Material e Utensílios

Para a realização deste processo de determinação de Gram, foram utilizados:

• Amostra de liquor 1

• Pipeta de Pasteur

• 2 laminas

• Pipeta

• Ponteira

• Turck

• Descarte de Ponteira

• Fita Teste

• Câmera New Bauer

• Microscópio

• Luvas

• 1 lamínula

• Óleo de Imersão

• Coloração

• Pinça

• Algodão

• Becker

• Pincel

• Solução Descorante GRAM

• Fucsina Fanicada

• GRAM Violeta Genciana

• GRAM Lugol

• Soro Fisiológico Salina

• Álcool Acido

• Iodo

• Papel Toalha

Procedimento para coloração de GRAM

• Colocar 5 gotas em duas lâminas esperar secar em seguida colocar 2 gotas de liquor.

• Cobrir a lâmina com Cristal de Violeta (10 segundos)

• Cobrir com solução de Iodo (5 segundos)

• Cobrir