ESTUDIO BIODIRIGIDO DE UN EXTRACTO ALCOHÓLICO DE FRUTOS DE SECHIUM EDULE (JACQ.) SWARTZ

1. RESUMEN

Sechium edule es el nombre científico de la chayote, vegetal muy común por las Américas y mismo por otras partes del mundo. La investigación evaluó el potencial de una variedad de la chayote en combatir tumores, haciendo después la caracterización de los componentes más activos contra el cáncer utilizando para esto la metodología de cromatografía.

2. RELACIÓN CON EL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DEL CONECTANDO SABERES

La relación más evidente entre nuestro tema de investigación y el tema del autor es que las dúas investigaciones envuelven la Sechium edule. Una relación más profunda es que se envuelven también en las investigaciones cuestiones de caracterización y análisis de una variedad de la S. edule, siendo en el artículo presentado una análisis de extractos alcohólicos e en nuestra investigación una análisis de fibras.

3. DELIMITACIÓN DEL TEMA

Análisis y caracterización del extracto alcohólico de frutos de Sechium edule en la evaluación de la actividad antiproliferativa y citotóxica en células cancerígenas.

4. OBJETIVOS

Este estudio tiene como objetivo aislar y caracterizar los componentes más activos del extracto alcohólico de Sechium edule (chayote) y analizar las propiedades antineoplásicas para determinar su actividad en dos líneas tumorales (L-929 y HeLa).

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal, extracción y aislamento

Se utilizaron frutos de la variedad Sw., var. nigrum spinosum de la S. edule, oriundos del Banco Nacional de Germoplasma Del México. Los frutos fueron utilizados cuando alcanzaron su madurez hortícola, entre 16 e 20 días después de la antesis. Secados por tres días hasta 10% de humedad, fueron macerados en partícula de 02 mm. Para realizar una extracción, se sumerge el macerado en metanol concentrado. Se filtró posteriormente con papel el extracto alcohólico, después evaporando el disolvente a presión reducida para obtener un extracto sin disolvente orgánico. Por final, se realizaran dos análisis cromatografías diferenciadas e una observación con luz UV, siendo preferidas para la investigación de la segunda fase de ensayos biológicos fracciones con base en la coloración de la cromatoplaca relacionadas con compuestos triterpénicos.

Evaluación de la actividad antiproliferativa

La evaluación de la acción anti-tumoral se realizó mediante la medición de la reducción del índice de proliferación celular y la toxicidad para las células. En los bioensaios se utilizaron líneas de células L-929 (fibrosarcoma de pulmón de ratón) y HeLa (cáncer cervical humano). Las líneas se mantuvieron como cultivos de monocapa suplementado con Suero Bovino Fetal. Tanto el extracto alcohólico y fracciones se solubilizaron en etanol absoluto y una solución tampón de fosfato, cloruro de potasio, fosfato de potasio, fosfato dibásico de sodio. La mezcla se centrifugó durante 5 min. Los sobrenadantes se filtraron para obtener una acción que se ha diluido a cinco concentraciones diferentes. Líneas de células HeLa y L-929 se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos de placas de medio de cultivo por la adición del extracto o las fracciones a las concentraciones indicadas y co-cultivadas durante 72h. Posteriormente las células se unen al eje se fijaron con glutaraldehído al 1% durante una hora, después se añadió la solución de cristal violeta para colorear el núcleo, como un método indirecto para medir el número de células de las placas se agitaron durante 10 min y el exceso de colorante se eliminó con agua destilada. Entonces se añadió ácido acético, agitó para solubilizar el colorante. La densidad óptica de las células se midió en espectrofotómetro de placas. Los bioensayos se realizaron dos veces con tres repeticiones.

Evaluación de la citotoxicidad

Los sobrenadantes de los ensayos de proliferación celular se emplearon para evaluar la presencia de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), encontrada en el citoplasma celular. El LDH es empleado para cuantificar el daño a la membrana celular. La actividad de LDH es medida por una prueba enzimática, donde el LDH catalizado es convertido en lactato de piruvato. En la segunda etapa de catálisis se transfieren protones y se convierte en sal de tetrazolio que es reducida en “formazan”, que puede ser identificada colorimétricamente. Los sobrenadantes se co-cultivaron a temperatura ambiente por 30 min con el kit de detección de LDH. Para determinar el porcentaje de citotoxicidad se requiere de un control positivo el cual permite obtener la toxicidad celular absoluta; para ello, 30 min antes de concluir el tiempo de cultivo se adicionó una solución con medio de cultivo, en relación 1:1; transcurrido el tiempo de cultivo se evaluó la citotoxicidad con el kit de detección de LDH. Las muestras fueron leídas en una densidad óptica de 490 nm en un lector de placas. Fueron establecidos tres controles por cada ensayo: el de fondo medio, positivo y negativo. Para determinar el porcentaje de citotoxicidad, se emplearon las lecturas de absorbancia; la diferencia entre el valor del control negativo y el valor experimental obtenido se dividió entre la diferencia del control positivo y el negativo. El cociente resultante se multiplicó por 100. Para eliminar el efecto de la absorbancia del medio de cultivo, se restó el valor promedio del control de fondo a los valores experimentales, el control positivo y el negativo.

Identificación de las fracciones activas y análisis estadístico

Las fracciones activas fueron sometidas al análisis de resonancia magnética nuclear de hidrógeno y a cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, usando un espectrómetro acoplado a un cromatógrafo con columna capilar conteniendo metil-fenil polisiloxano como fase estacionaria. La columna se mantuvo en 100°C por 1 min y luego se calentó a la 260°C, creciente de 10°C a cada 1 min. El análisis de las masas separadas se hizo por impacto electrónico. Se hecho también el análisis estadístico considerando los valores de absorbancia obtenidos en los ensayos de proliferación, cuantificando el número celular de cada cultivo. Estos valores fueron presentados a un análisis de varianza. Por final, se empleó un software, teniendo como variables de los extractos las fracciones y concentraciones.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los primeros bioensayos se realizaron con el extracto crudo y se observó que las actividades antiproliferativa y citotóxica fueron de tipo dosis dependiente.