Manobras Assepticas

Manobras Assépticas

Professora: Edite

Turma: CAM 272

Alunos: Mariana Scotellaro

Thayná Nunes

Vanessa Menezes

Waldyr Ramos

Data de entrega: 15 de Julho de 2013.

Introdução

O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

Alguns procedimentos são essenciais na hora da preparação de cada meio de cultura para a obtenção de melhores resultados e evitar contaminações, como nos diferentes casos: quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados; quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis e os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.

Ágar nutriente (AN)

Meio relativamente simples, de fácil preparo e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de microbiologia.

Utilidade: análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras, conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da criopreservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC) e observação da esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.

Interpretação:

Cor original do meio: branco opalescente

Positivo: Crescimento na superfície do ágar;

Negativo: Ausência de crescimento.

Técnicas assépticas

As chamadas "técnicas assépticas" são indispensáveis para o isolamento, cultivo e identificação de microrganismos. Elas têm a finalidade de evitar contaminações do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento por microrganismos presentes no meio (ar, água, mãos, roupas, etc.).

Há algumas medidas essenciais que devem ser observadas pelo manipulador na ocasião da prática de técnicas de crescimento e isolamento de microrganismos, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no laboratório.

Tubos ou frascos

Toda vez que fizer uma semeadura ou inoculação de microrganismos, utilizando tubos de ensaio, tubos de rosca ou frascos do tipo Erlenmeyer, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). A tampa deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo da mão. Caso esteja repicando a cultura para outro tubo, o mesmo procedimento deve ser feito com este outro tubo antes da inoculação dos microrganismos. Incliná-los, sempre, a aproximadamente 30°. No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Após a retirada do material com alça ou pipetas, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Descartar as ponteiras usadas em recipientes, de preferência, contendo soluções detergentes ou desinfetantes.

Condições de incubação

As técnicas empregadas para o isolamento e cultivo de microrganismos dependem da fonte (alimentos, tecidos vivos, água, ar, etc.) e do tipo de microrganismo que se deseja isolar (enteropatógenos, bactérias lácticas, fungos filamentosos, leveduras, etc.). Por exemplo, alguns microrganismos crescem somente ou preferencialmente em condições de anaerobiose e, portanto, após o repique em meios de cultura adequados, os tubos ou placas devem ser acondicionados em câmaras de anaerobiose. Na ausência desta, existem outros equipamentos com o fim de manter uma atmosfera livre de oxigênio, como jarras de anaerobiose e envelope plástico para anaerobiose.

Cultivo em tubos contendo meios de cultura líquidos

Tal procedimento é bastante útil, pois possibilita a rápida e elevada multiplicação de microrganismos. Se o objetivo for o isolamento, os microrganismos podem ser crescidos nos meios de cultura líquidos adequados, seguido por semeadura em placas. A inoculação de microrganismos em meios de cultura líquidos pode ser feita com o auxílio de uma alça de platina previamente flambada ou alça descartável esterilizada, caso os microrganismos sejam provenientes de meios sólidos ou semi-sólidos, ou através de uma pipeta, normalmente quando se está fazendo o repique de uma cultura que está armazenada em meio líquido.

Inoculação por estrias ou esgotamento em placas de ágar

A técnica de semeadura por estrias múltiplas consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra, que após a incubação, formarão as colônias isoladas sobre a superfície do ágar. A execução é simples e devem ser tomados alguns cuidados para que realmente consiga o isolamento das bactérias. Primeiramente, deve-se flambar a alça de platina (ou então pode-se utilizar alças de plástico descartáveis previamente esterilizadas) e introduzi-la no meio contendo as bactérias. Fazer então o estriamento na superfície do ágar da placa de Petri Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes. A quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, sendo que em muitos casos, é necessário diluir o meio do qual os microrganismos são provenientes; caso contrário, pode haver a justaposição das colônias e por isso não se pode isolá-las.

Objetivo

Analisar o crescimento de colônias de bactérias em diferentes tipos de manobras assépticas

Materiais e Reagentes

• Estrato de Levedura

• Extrato de Carne

• Peptona

• Cloreto de Sódio

• Agua destilada

• 10 placas de ensaio

• Tubos de Ensaio

• Autoclave

• Cepa Citrobacter

• Jornal

• Pipetas de 5 mL

• 1 Erlenmeyer de 250 mL

• Alça de Inoculação

• Alça de Drigalski

• Bico de Bunsen

• Algodão

• Gases

• Rolo de PVC

• Pinça

• Caneta de Retroprojetor

• Pera

• Bastão de Vidro

• Bécher

• Estufa – 36°C

• Pipeta automatica

Procedimentos

Primeiramente, todas as vidrarias a serem utilizadas nas práticas foram autoclavadas para completa esterilização das mesmas.

Foram autoclavadas todas as placas, todos os tubos, a solução de ágar e caldo nutrientes semi-preparados e pipetas.

O Ágar Nutriente foi preparado com as seguintes substancias: 1 g de Peptona de Carne + 3 g de Extrato de Carne + 12 g de Ágar puro + 200 mL de água Destilada.

O Caldo Nutriente foi preparado utilizando as seguintes substancias: 0,75g de Peptona de Carne + 0,45g de Extrato de Carne + 150 mL de água destilada.

Após a autoclavação o ágar nutriente foi vertido de forma asséptica para as placas de petri.

Com isso, deu-se início ás manobras assépticas:

• Primeira Manobra: Transferência de Caldo Nutriente para um tubo estéril.

1. Pegar um tubo de ensaio estéril, um tubo contendo caldo nutriente e uma pipeta estéril.

2. Ligar a chama do bico de Bunsen para trabalho asséptico

3. Desenrolar a pipeta em volta do fogo (área estéril) conectando após a pêra.

4. Pegar o tubo de ensaio contendo o caldo nutriente, abri-lo próximo ao fogo, flambar a boca do frasco e pipetar 2,0 mL do caldo.

5. Flambar novamente a boca do frasco e pegar o outro tubo estéril.

6. Abrir o tubo, flambar e colocar o caldo pipetado dentro do tubo.

7. Realizar a flambagem e fechar o tubo, tudo em volta do fogo.

8. Colocar os dois tubos na estufa à 36ºC.

• Segunda Manobra: Transferência de uma Cepa para um tubo contendo Caldo Nutritivo através de uma alça de Inoculação.

1. Flambar a alça de Inoculação.

2. Abrir o tubo contendo a cepa, flambar a boca, esfregar a alça de inoculação na parede do tubo para resfriamento. Mergulhar a alça na cepa, flambar a boca, fechar e guardar o tubo.

3. Pegar um novo tubo estéril contendo o caldo nutriente, flambar a boca, mergulhar a alça e retirá-la sem resíduos.

4. Flambar a boca do tubo e fecha-lo.

5. Flambar a alça de inoculação para sua esterilização.

6. Colocar o tubo inoculado com cepa na estufa à 36ºC.

• Terceira manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento.

1. Pegar a alça de inoculação e flambar até que a alça fique rubra.

2. Pegar o tubo de ensaio onde se continha a cepa, abrir e flambar a boca do tubo.

3. Mergulhar a alça de inoculação, retirar, flambar a boca do tubo e fechá-lo, tudo na zona estéril.

4. Abrir a placa de petri estéril contendo o ágar nutriente perto do fogo.

5. Fazer movimentos de Zig- Zag com a alça de inoculação até um pedaço da placa em 3 posições diferentes, sem encostar nas partes já estriadas, espalhando a cepa linearmente pelo meio de cultura, paralelo á placa, sem que haja o perfura mento do mesmo, sem flambar a alça de inoculação. Como mostra a figura a seguir:

6. Levar a placa para a estufa á 36°C.

• Quarta Manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento com flambagem.

1. Pegar a alça de inoculação e flambar até que a alça fique rubra.

2. Pegar o tubo de ensaio onde se continha a cepa, abrir e flambar a boca do tubo.

3. Mergulhar a alça de inoculação, retirar, flambar a boca do tubo e fechá-lo, tudo na zona estéril.

4. Abrir a placa de petri estéril contendo o ágar nutriente perto do fogo.

5. “Dividiu-se” a placa em 3 partes, na primeira foram feitos movimentos em zig zag com a alça contendo o microrganismo, após isso flambou-se a alça de inoculação passando pela parte estriada em direção a segunda parte ainda estéril, flambou-se novamente a alça de inoculação e repetiu-se o procedimento, agora na última parte.

6. Levar a placa para a estufa á 36°C.

• Quinta manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento com flambagem.

1. Pegar a alça de inoculação e flambar até que a alça fique rubra.

2. Pegar o tubo de ensaio onde se continha a cepa, abrir e flambar a boca do tubo.

3. Mergulhar a alça de inoculação, retirar, flambar a boca do tubo e fechá-lo, tudo na zona estéril.

4. Abrir a placa de petri estéril contendo o ágar nutriente perto do fogo.

5. “Dividiu-se” a placa em 3 partes, na primeira foram feitos movimentos em zig zag com a alça contendo o microrganismo, após isso flambou-se a alça de inoculação passando pela parte já estriada apenas uma vez e indo em direção a segunda parte sem encostar novamente na parte estriada, flambou-se novamente a alça, passou a alça pela parte estriada anteriormente somente uma vez e repetiu-se o movimento.

6. Levar a placa para a estufa á 36°C.

 

• Sexta Manobra: Método de "espalhamento" em placa

1. Com o auxílio de uma pipeta automática, pipetar 0,1 mL da cepa no centro da placa de petri.

2. Pegar a alça de drigalski e mergulha-la no álcool, escorrer o excesso e flambar rapidamente para o vidro não estourar.

3. Espalhar o conteúdo com a alça na placa de petri de maneira uniforme

4. Flambar a alça e mergulhar no álcool.

5. Levar a placa para a estufa á 36°C.

Resultados e Discussões

• Primeira Manobra: Transferência de Caldo Nutriente para um tubo estéril.

Após a retirada dos dois tubos da estufa, que permaneceu durante aproximadamente 48 horas, notou-se que os meios de cultura permaneceram límpidos. Isso se deve a não contaminação dos meios por outras bactérias e também pelo bom procedimento realizado durante esta manobra.

• Segunda Manobra: Transferência de uma Cepa para um tubo contendo Caldo Nutritivo através de uma alça de Inoculação.

O tubo contendo a cepa adotou uma turbidez representativa de uma infecção por algum microrganismo. A comparação era feita entre os dois tubos anteriores e este contendo a cepa inoculada. Caso, os dois primeiros tubos permanecessem límpidos, o meio não foi contaminado, mas caso houvesse alguma turbidez, semelhante á esse tubo com cepa, algum erro fora cometido.

Figura – Diferença entre tubo límpido (não contaminado á esquerda) e tubo túrbido (contaminado à direita)

• Terceira manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento.

Nesta manobra, sem a flambagem da alça de inoculação percebe-se que há a formação de diversas colônias independente das estrias realizadas. Não há como visualizar todas as colônias separadamente, pois esta técnica não é correta para esse tipo de resultado.

Figura – Placa com esgotamento sem flambagem

Características da placa:

- Houve o crescimento apenas da cepa utilizada

-Colônias redondas e de mesmo tamanho

-Cor: bege

-Aparência rugosa

-Estruturas algodanosas

-Bordas Irregulares – Côncavas

• Quarta Manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento com flambagem.

Nesta manobra percebem-se as mesmas características que a manobra anterior, mas o que as diferencia visualmente é o crescimento desigual das colônias com o passar das estrias. Isso ocorre, pois com a flambagem da alça de inoculação, retiram-se todas as bactérias e no momento de realizar a próxima estria, retira-se a bactéria já alí inoculada, mas ela é “arrastada” para o outro local, para que assim, possa ser visualizada o seu crescimento diferenciado.

Figura - Placa de esgotamento com flambagem

Características da placa:

- Houve o crescimento apenas da cepa utilizada

-Colônias redondas com tamanhos diferenciados de acordo com a estria.

-Cor: bege

-Aparência rugosa

-Estruturas algodanosas

-Bordas Irregulares – Côncavas

• Quinta Manobra: Plaqueamento utilizando a técnica de esgotamento com flambagem.

Nesta manobra percebem-se as mesmas características que a manobra anterior, mas o que as diferencia visualmente é o crescimento mais isolado das colônias. Isso ocorre, por conta da flambagem da alça de inoculação e do arraste a partir da área com menos bactéria.

Conclusão

Conclui-se que é necessário saber das técnicas de Plaqueamento para a análise de colônias para que ao fim, saber qual é o verdadeiro tipo de colônia que inoculou.

Conclui-se que também é necessária a sabedoria sobre técnicas que esterilizem os materiais que serão utilizados em práticas de microbiologia, pois é muito importante a morte de qualquer bactéria que não seja a qual que se esteja analisando.

Bibliografia

• http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42

• http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2004.pdf

• http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html