Metodologia Cometa

SOLUÇÕES USADAS:

1. PBS (1X) –SALINA TAMPONADA

	Para 100 mL		Para 500 mL		Para 1000 mL
NaCl	0,8 g		4g		8 g
KCl	0,02 g		0,1 g		0,2 g
KH2PO4	0,02 g		0,1 g		0,2 g
Na2HPO4	0,088 g		0,44 g		0,88 g
Água destilada (completar)	100 ml		500 ml		1000 ml

Acertar o pH para 7,4  usando NaOH. Em estocar em refrigerador (geladeria 4°        C) por no máximo 90 dias.

1. AGAROSE PRÉ-COBERTURA (0,75%) – Preparar na hora

Químicos		Para 100 mL
Agarose NMP	2,2g
PBS 1X (pH 7,4) livre de Ca+2 e Mg+2	100ml

Ferver a agarose em micro-ondas e manter em banho-maria a 60°C. Mantém-se o recipiente com agarose e banho-maria a 60°C, mergulha-se a lâmina no lado fosco no gel, removendo o excesso de apenas um lado, com papel toalha. Deixa-se secar completamente em posição horizontal à temperatura ambiente, por no mínimo 24 horas. Guardar empilhadas na embalagem de origem no refrigerador.

1. AGAROSE LOW MELTING (LMP) (0,5%) – Preparar na hora

Químicos		Para 100 mL
Agarose LMP	0,75g
PBS 1X(pH 7,4) livre de Ca+2 e Mg+2	100mL

A dissolução da agarose deve ser feita em forno de micro-ondas (em menos de 1 min em potência 3) e o gel liquefeito mantido à 37°C, em banho-maria, durante o seu uso. Um eventual armazenamento pode ser feito, em alíquotas, em refrigerador a 4°C. No entanto, essa agarose pode ser utilizada apenas mais uma vez, pois fusões sucessivas alteram sua concentração. A agarose LMP derretida deve permanecer à temperatura de 37°C no momento de ser utilizada para embeber as células.

1. SOLUÇÃO DE LISE – Estoque

Qímicos	Para	1000ml
NaCl (2,5M)	146,1g
EDTA (100mM)	37,2g
Tris-HCl (10mM)	1,2g

Acrescenta-se 700ml de água destilada em vidraria graduada e ajusta-se o pH para 10-10,5 com o auxílio de NaOH. Após o ajuste, completa-se para 1000ml com água destilada e finalmente adiciona-se 10g de N-lauril-sarcosinato. O armazenamento pode ser feito à temperatura ambiente, em frasco âmbar, de forma a prevenir a incidência de luz por um tempo de 90 dias.

Organização do material

• As lâminas pré-cobertas devem ser numeradas e fora da geladeira.
• A solução de lise deve estar distribuída nas cubetas verticais e na geladeira.
• A solução salina para lavagem de lâminas deve estar pronta e na geladeira.
• A agarose LM de vê estar no banho-maria a 37oC.
• Os eppendorfs ou tubos falcon com as amostras devem estar numerados e imersos em gelo picado.
• A bancada deve estar limpa e organizada com caixas e ponteiras amarelas, lamínulas, dois descartadores, cubetas e pipetas.

Preparação das amostras e lise das células

OBS. O tempo e transporte das amostras te das amostras devem ser observados, pois a qualidade da avaliação do material biológico é dependente das condições da amostra e dos aspectos operacionais, como uso de freezęr. É recomendável não transportar as amostras em contato direto com o gelo.

OBS. Para análises em culturas de linfócitos, as amostras são obtidas por "venipuncture" e são imediatamente processadas em culturas, onde amostras de sangue heparinizadas (0,3 mL) são adicionadas a 4,7 mL de meio de cultura composto de 4,025 mL de Hams F10 suplementado com 0,5 mL (10%) de soro fetal e 0,075 mL (1,5%) de fitohemaglutinina e antibióticos (100 IU penicilina e 100 μ1/mL estreptomicina (MURGIA et al., 2008).

• O sangue periférico deve ser coletado de cada participante por venepuncture em seringas heparinizadas.
• O sangue coletado dos pacientes deve ser dividido em três alíquotas de 30 µL para cada estudo: dano basąl, dano por mutágeno e para reparo. A primeira aliquota deve se processada imediatamente, a segunda deve ser tratada com mutágeno.
• As amostras a serem tratadas com mutágeno in RPMI 1640 a 37° por 30 minutos devem ser lavadas por tres vezes em PBS para retirar os resíduos do mutágeno, com centrifugação por dez minutos (1500 rpm).
• Para reparo, as células, após tratamento com mutágeno, devem ser incubadas por duas horas e o sobrenadante será removido para o processamento do teste cometa.
• Depois da última lavagem, retira-se 30 μL de células suspendidas em PBS mistura-se com 110 μL 0,5% de Agarose “Low mellting" e coloca-se em forma de gotas sobre as lâminas com pré-cobertura de agarose normal e cobertas com as lamínulas.
• Preparar três lâminas para cada tratamento: (1) Danos basais (Lâminas A, B e C); (2) exposição aos mutágenos (Lâminas C, D e E) e (3) após exposição (Láminas F, G, I).
• Para as lâminas a serem expostas ao mutágeno (peróxido de hidrogénio).
• Deixar o gel solidificar por 10 minutos em temperatura ambiente, mantendo as lâminas na posição horizontal.
• Retirar a lamínula cuidadosamente.
• Inserir as lâminas em cubetas jă com solução de lise gelada e protegida da luz. As cubetas têm capacidade para 18 laminas (16 são colocadas de duas a duas, de costa uma para outra, nas ranhuras da cubeta e mais duas são colocadas uma em cada parede da cubeta com o gel voltado para solução).
• As lâminas devem permanecer pelo menos 2 horas em solução de lise ou, no máximo, uma semana, na geladeira; para tecidos, não ultrapassar 72 horas

Eletroforese

• Verificar o volume necessário de tampão de eletroforese (solução de uso) conforme o tamanho da cuba e número de eletroforese.
• Para 1 L de tampão de eletroforese (solução de uso) em água destilada gelada adicionar 30 mL. da solução A (NaOH)+ 5 mL. solução B (EDTA 200 mM). Completar para 1 litro com água destilada gelada e acertar o pH>13. Manter na geladeira.
• Colocar gelo picado ao redor da cuba horizontal de eletroforese.
• Verificar na fonte as condições de corrida: 25V, 300mA, 15 minutos.
• Colocar as lâminas que estão na solução de lise na geladeira sobre a cuba uma ao lado da outra, cuidando para retirar o excesso da solução de lise das lâminas, enxugando a parte sem o gel com papel toalha.
• Posicionar as lâminas lado a lado c cuidar paru que fiquem retas.
• Colocar o tampão de eletroforese gelado pelas canaletas laterais da cuba o suficiente para cobrir as lâminas e deixar de molho por 20 minutos.
• Ligar RUN c acertar, imediatamente, com o tampão de eletroforese a corrente para mA.
• Se a corrente estiver menor que 300 mA, adicionar mais tampão até 298 mA (ela irá aumentar até 300 mA no decorrer de 15 min).
• Verificar se a voltagem está em 25 V caso esteja menor, retirar tampão até 280 mA.
• Correr eletroforese durante 15 minutos e, com o auxílio de uma pinça, colocar as lâminas sobre uma bandeja na posição horizontal.
• Cobrir, cuidadosamente, as laminas com a solução neutralizadora, com o auxílio de uma pepita Pasteu.
• Esperar 5 minutos e repetir o procedimento por três vezes.
• Retirar o excesso de solução inclinando a bandeja com cuidado na pia.
• Cobrir as lâminas com água destilada mantendo as lâminas na bandeja.
• Retirar o excesso de água inclinando a bandeja com cuidado na pia. Repetir por uma vez.
• Deixar secar por 24 horas à temperatura ambiente ou 1,5 h -2h a 37°, sobre bandeja na posição horizontal. Não precisa ser ao abrigo da luz.

Fixação - pode ser feita no claro

• Colocar as lâminas secas em cubetas secas, e fixar por 10 min com a solução de fixação, que pode ser reutilizada.
•  Lavar 3 vezes com água destilada, mantendo as lâminas dentro das cubetas.
• Deixar secar as lâminas por 24 horas a temperatura ambiente ou 1,5-2 h a 37C, sobre bandeja na posição horizontal.

Coloração com prata- procedimentos a serem feitos ao abrigo da luz, com iluminação por lâmpada vermelha.

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