RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – ELISA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - ICBS

ALUNA: Aldilane Lays Xavier Marques   Curso: Ciências Biológicas – Bacharelado

Disciplina eletiva: Virologia Essencial   Professora: Alessandra Abel Borges

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – ELISA

Local: A aula prática foi ministrada no Laboratório de Pesquisas em Virologia e Imunologia – LAPEVI no dia 07/02/2018.

Responsáveis: Profª Dra. Alessandra Abel Borges e Tec. Ma. Ana Rachel Vasconcelos De Lima

Objetivo

Identificar qualitativamente a presença de anticorpos IgG para sorotipos de antígenos dos quatro tipos de vírus da Dengue, buscando expor aos alunos se as amostras disponíveis eram positivas ou negativas, através do teste de ELISA indireto. Além de quantificar os resultados com o auxílio de equipamento medidor de Densidade Óptica.

Materiais e métodos

Foram utilizados pela aluna orientada pela professora responsável e a técnica do LAPEVI os seguintes materiais: Pipetas automáticas, Pipeta Combitips advanced, Ponteiras, luvas, máscara, placa para depositar as amostras, proveta, eppendorfs, descarte com hipoclorito 2%.

        Para realização do teste de ELISA indireto foi utilizado o kit PanBio Dengue IgG indirect ELISA, seguindo toda a orientação que constava na bula do produto. Também foi crucial para o desenvolvimento do teste algumas amostras de soro de alguns pacientes, as quais pertenciam ao “coleção” do laboratório; Estufa de CO2 a 37ºC para incubação das amostras.

Introdução

        A dengue é uma das doenças mais conhecidas da atualidade, por seu perfil agressivo que pode levar os infectados a desenvolverem sintomas debilitantes ou até mesmo a óbitos. Os sorotipos de vírus que provocam esse estado nos pacientes são DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 transmitidos pelas fêmeas dos mosquitos Aedes aegypti e também do Aedes albopictus. Eles também são vetores de outras doenças, como: Chikungunya, Febre Amarela e Zika (muito evidenciado no último ano pelos históricos de microcefalia em recém-nascidos) (OMS, atualizado em 2017).

        O vírus da dengue é predominantemente disseminado em países de climas tropical e subtropical, como o Brasil, principalmente em áreas urbanas e semi-urbanas. O vírus é transmitido através da picada de mosquitos vetores infectados e passa por um período de incubação de 4-10 dias no homem. Dentro desse período, os portadores desse vírus também são capazes de transmiti-lo através da picada de outros mosquitos para os que não estão infectados (OMS, atualizado em 2017).

Consoante alguns estudos, foi estimado utilizando métodos cartográficos, que existem 390 milhões (95% de intervalo credível 284-528) de infecções por ano, sendo 96 milhões (67-136) aparentemente, com qualquer nível de gravidade da doença. Este total de infecção é mais de três vezes a estimativa da carga de dengue da Organização Mundial de Saúde (Bhatt S, Gething PW et. al, 2013).

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Até o momento, apenas uma vacina foi licenciada no país,a Dengvaxia, desenvolvida pela empresa francesa Sanofi Pasteur. Ela é feita com vírus atenuados e protege contra os quatro sorotipos de dengue existentes. Ela possui a estrutura do vírus vacinal da febre amarela, o que lhe dá mais estabilidade e segurança (Bula Devaxia  - Sanofi Pasteur, 2015). Entretanto, recentemente, o laboratório fabricante da vacina revelou baseado em novos estudos que a Dengvaxia em pessoas que nunca foram infectadas aumentava o risco de desenvolvimento das formas mais graves da doença se adquirissem o vírus, do que em pessoas que já tiveram a doença (Info. Sanofi Pasteur, 2017). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) confirmou a informação e pediu que as pessoas seguissem as recomendações da fabricante até que surgissem novos estudos, visto que esses resultados ainda são cabíveis de mudanças, pois o medicamento continua sendo monitorado e pesquisado mesmo depois de receber o registro e ser comercializado (Revista Encontro Digital, 2017).[pic 5]

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Para identificar o vírus em pacientes podem ser utilizados alguns métodos de análises clínicas, como: a pesquisa do antígeno NS1, uma glicoproteína que é bem conservada em soro de pacientes infectados pelo vírus, o qual pode ser aplicado nos primeiros cinco dias após o surgimento dos sintomas; mas depois dos seis dias, os métodos sorológicos de imunocromatografia, Elisa IgM e Elisa IgG. O último demonstra resultados positivos a partir do 9º dia da doença, na infecção primária, e até mesmo a partir do 1º dia de doença na infecção secundária.

Na aula prática do dia 07/02/2018, ministrada pela Profª. Dra. Alessandra Abel, houve uma demonstração de teste ELISA indireto, utilizando amostras de pacientes com suspeita de Dengue, nas quais buscou-se avaliar a presença de anticorpos da classe IgG contra dengue, o que evidenciaria que aqueles organismos já haviam tido contato com o vírus.[pic 9]

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Atividades realizadas na aula prática

Seguindo as instruções contidas na bula do Kit PanBio - DENGUE IgG ELISA INDIRETO, o qual fornecia: 1. Antígenos de Dengue (sorotipos 1, 2, 3, 4) micropoços revestidos (poços 12x8); 2. Concentrado de Tampão de Lavagem - Um frasco, 60 ml de 20x; 3. Soro diluente - Dois frascos de 50 ml ( Rosa); 4. IgG HRP anti-humano conjugado - Um frasco, 15 ml (Verde); 5. tetrametilbenzidina TMB - um frasco, 15 ml.; 6. Soro de Controle Positivo - 1 Vermelho - frasco tapado, 200 ul de soro humano (contém 0,1% de azida de sódio e 0,005% de sulfato de gentamicina); 7. Soro calibrador - 1 Amarelo - frasco tapado, 400 ul de soro humano (contém 0,1% de azida de sódio e 0,005% de sulfato de gentamicina); 8. O soro de controle negativo - 1 Verde - frasco tapado, 200 ul de soro humano (contém 0,1% de azida de sódio e 0,005% de sulfato de gentamicina); 9. Solução Stop - Um frasco, 15 ml.