Bioquimica Infravermelho em Quimica Clinica

BIOQUÍMICA INFRAVERMELHO EM QUÍMICA CLÍNICA DE ROTINA

Cromógenos e a Absorbância da Luz

A química clinica de rotina é baseada na detecção de cromóforos corantes) ou medidas diretas de participantes na reação química, por ex. NADH em reações enzimáticas, ou bilirrubinas em ensaios de oxidação da bilirrubina.

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A química clinica tradicional tem historicamente usado indicadores de reações os quais são detectados nas regiões visíveis ou U.V. do espectro. Cromóforos vermelhos, como os produzidos pelos tradicionais cromógenos tipo Trinder em reações com peroxidase , absorvem luz verde e são detectados entre 500-540 nm. Indicadores amarelos, como p-nitrofenol usado para fosfatase alcalina e G-gt, absorvem luz azul, substâncias que absorvem U.V. são incolores. Os novos cromógenos que absorvem na faixa infravermelho são geralmente de cor azul clara e absorvem luz vermelha e infravermelho entre 600-850 nm. Muitos dos cromógenos por si próprios são vermelhos, e o cromógeno vermelho reage para formar um cromógeno azul que absorve na faixa infravermelho. No ensaio existe uma mistura de luz vermelha e azul clara enquanto o branco permanece vermelho.  As mudanças não são acentuadas aos nossos olhos, devido a que a mistura de luz vermelha e azul produz um vermelho escuro. Os espectrofotômetros não tem dificuldades em distinguir  cromógenos azuis na presença de cromógenos vermelhos.

O gráfico ao lado ilustra as características das absorbâncias espectrais da bilirrubina, hemoglobina e lipemia.

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É aparente que as absorbâncias destas substancias são muito elevadas nas regiões visíveis e U.V. do espectro. As absorbâncias destas substancias diminuem progressivamente da região U.V. (abaixo de 400 nm) do espectro, até a região visível (400-620 nm) e é mínima na região infravermelho. (após aprox. 620 nm).

Adicionalmente, as absorbâncias de substancias cromáticas são extremamente variáveis nas regiões U.V. e visíveis. Em contraste, a hemoglobina e a bilirrubina tem baixa absorbância na região infravermelho e a absorbância da lipemia diminui gradualmente conforme o comprimento de onda.

Características da luz infravermelho

A característica principal da luz infravermelho a qual é importante na química clinica, é a baixa quantidade de sua refração comparada com as luzes visíveis e U.V. A luz infravermelho praticamente não se desvia enquanto a luz visível se desvia quanto mais a cor muda de vermelho, laranja, verde, azul e violeta. A luz ultravioleta se desvia severamente.

Lipemia 

A lipemia aparenta aos olhos como branco leitoso. Contudo, mais apropriadamente do que absorver luz constantemente conforme a mudança de comprimento de onda, a lipemia absorve fortemente no ultravioleta e progressivamente menos, conforme se muda para a faixa visível e para infravermelho.

A absorbância da luz da lipemia pode ser explicada examinando-se a natureza física da lipemia. A lipemia consiste de moléculas de gordura agregadas em forma de gotas chamadas quilomicrons.

Os quilomicrons exibem propriedades similares 'a lentes óticas e a luz é desviada seguindo os mesmos princípios do prisma.

Este fenômeno provoca o desvio da luz nos comprimentos de ondas curtos em uma solução contendo lipemia:

Em contraste, a luz infravermelho passa através desta mesma solução sem sofrer praticamente nenhum desvio.

As características da difração de luz por partículas é bem conhecida. As nuvens são uma suspensão de partículas de água no ar.

As fotografias aéreas infravermelhas tem sido reconhecidas por décadas como as que permitem obter fotografias perfeitas do solo, mesmo com presença de neblina ou nuvens. A luz visível ou ultravioleta se dispersa em virtude das gotículas de água.

Os filtros que excluem a luz U.V. são usados para fotografias de paisagens porque a luz U.V. é distorcida quando passa, mesmo que seja por uma neblina muito fraca.

Espectrofotometria Automatizada

O comportamento contrastante entre a luz infravermelho, luz visível e ultravioleta é importante no entendimento da performance do instrumento clinico automático. Particularmente, muitas das variações de resultados de laboratórios para laboratórios , e mais importante, de instrumento para instrumento, pode ser explicado baseado no comportamento da luz na espectrofotometria.

Os elementos fundamentais dos sistemas de medidas espectrofotométricos de todos os analisadores clínicos " líquidos" tem elementos básicos em comum.

A luz proveniente da lâmpada é colimada em um feixe de luz o qual passa através da solução de teste. Variadas maneiras , incluindo-se lentes ou fibras óticas são usadas para executar esta colimação. Teoricamente, a única modificação suposta 'as características da luz é a quantidade de luz absorvida pela solução presente no seu caminho. No caminho desta luz pode ser incluído um ou mais fendas ou fibras óticas.

A luz visível ou ultravioleta não se comporta como a teoria da passagem da luz. Em graus variados, as difrações devidas 'a soluções lipemicas, causam a perda desta colimação.Os efeitos desta perda de colimação variam, mas coletores de fibra ótica ou fendas, complicam estes efeitos. Pequenas diferenças na geometria dos elementos óticos causam o grau de variação destes efeitos. Desta maneira, mesmo instrumentos do mesmo modelo podem produzir diferentes níveis de interferência na presença de lipemia. Conseqüentemente, não é incomum em dois instrumentos do mesmo modelo produzirem resultados diferentes de soros controles fracamente turvos.

Em contraste, a luz infravermelho se comporta de uma maneira mais próxima da teoria porque a luz é fracamente difratada em soluções lipemicas. Conseqüentemente, não somente são diminuídos os efeitos da lipemia;as variações de instrumento para instrumento são mínimas. Quando químicas infravermelhos são usadas, os laboratórios muitas vezes conseguem paridades de resultados entre instrumentos de diferentes fabricantes.

A detecção infravermelho melhora muito a relação sinal-ruido em espectrofotômetros clínicos. Nesta discussão , sinal é a quantidade de absorbância produzida por uma quantidade do analito, usualmente referida pela sensibilidade fornecida pela diluição amostra - reagente. Ruído é a quantidade de absorbância de fundo das substâncias cromáticas presentes na amostra. Em geral, a sensibilidade do cromógeno por molécula do analito determina a quantidade de sinal. A absorbância de fundo devido 'as substancias cromáticas do soro determina o ruído. A relação sinal-ruido das detecções infravermelhos, e as variações de instrumento para instrumento fornecem vários benéficos efeitos. Estes efeitos serão explorados em termos de: