Família Enterobacteriaceae Compreende os Bacilos Gram-negativos.

1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Família Enterobacteriaceae compreende os bacilos Gram-negativos.
São os organismos mais isolados com frequência de amostras clínicas enviadas aos laboratórios de microbiologia . é uma família muito abundante, incluindo uma grande variedade de bactérias patogênicas. Os indivíduos da família Enterobacteriaceae são bastante conhecidos, alguns pertencem a microbiota normal dos intestinos de seres humanos e animais como a Escherichia coli, outros como habitantes do solo ou da água e outros podem estar implicados em vários processos patogênicos, incluindo por exemplo os gêneros Salmonella, Proteus, Shigella e Yersinia. 

A diferenciação dos gêneros e espécies é realizada por meio de uma série de provas bioquímicas. Algumas espécies em um mesmo gênero são muito semelhantes, sendo necessário grande número de provas para diferenciá-las.

Para identificação (gênero e espécie) das bactérias da família Enterobactericeae, são realizadas  provas de citrato, uréia e em meio SIM (Sulfeto de Hidrogênio, Indol e Motilidade).

Prova de citrato: baseia-se no princípio de que algumas enterobactérias tem a habilidade de utilizar o citrato com única fonte de carbono. O meio contém citrato de sodio, sais de amônio.  o  indicador  e o azul de bromotimol. Com a facilidade de transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul.

Prova de uréia: há bactérias que possuem a enzima urease – capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio. O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a coloração pink.

 Meio SIM: o meio de cultura agar SIM contém peptonas (a cisteína é um dos componentes) e tiossulfato de sódio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que atua como indicador da presença de H2S. Como o H2S é incolor, e por conseguinte não é visível, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel. A presença deste composto ocorre ao longo da linha de inoculação e indica que houve produção de sulfureto de hidrogênio (reação positiva). A ausência do precipitado negro evidencia uma reação negativa. E a formação de um halo preto na superfície do meio, indicará se a bactéria é fermentadora de glicose.

O meio de SIM é um meio semi-sólido que também pode ser usado para detectar a presença ou ausência de mobilidade nas bactérias e a produção de indol.

Prova de produção do Indol: este é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura. Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela formação de um anel vermelho na parte superior do tubo, após a adição do reativo de Kovac.

Prova da motilidade: indica indiretamente a produção de flagelos, sendo notada através da turvação do meio. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio.

Para determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, é realizado o antibiograma ou TSA (teste de susceptibilidade antimicrobiana). Este método baseia-se na capacidade de difusão do antibiótico que se encontra impregnado em discos de papel de filtro, através de um meio sólido, inibindo o crescimento microbiano, evidenciado pela formação de halos de inibição em torno dos discos.

1. OBJETIVOS:

• Executar provas bioquímicas para identificação de gêneros e espécies de bactérias da família Enterobactericeae, através da verificação das transformações metabólicas que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas do microorganismo.
• Executar o antibiograma pelo método de difusão em meio sólido para determinar a sensibilidade das bactérias a diferentes antimicrobianos.

1. MATERIAIS

1. Provas de identificação bacteriana :

• alça de platina;

• bico de Bünsen;

• colônia bacteriana em suspensão a ser identificada;
• tubos de ensaio contendo meios de cultura (citrato, uréia e SIM);
• estante para tubos de ensaio;
• estufa;
• tabela para leitura de resultados.

1. Antibiograma ou TSA

• Placa de Petri contendo meio de cultura Mueller Hintor;
• Discos de difusão de antibióticos;
• Cultura bacteriana em Caldo Nutriente;
• Bico de Bunsen;
• Swab;
• Pinça ;
• Estufa;
• Régua.

1. METODOLOGIA

Prova de citrato: semeia a bactéria no meio sólido inclinado de citrato contendo azul de bromotimol como indicador, inocula o meio com a bactéria, usando para isso, alça em agulha e em linha reta.

Prova de uréia: A prova consiste em transferir uma porção do crescimento bacteriano com uma alça para o meio contendo uréia, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol.

Provas de produção de H2S: para este teste, inocula-se a bactéria no meio SIM que tem o tiossulfato como fonte de enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produção de sulfeto de hidrogênio, com o auxílio de uma alça em agulha.

Provas de produção de indol: A prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich através da parede interna do tubo.