O MÉTODO DE CURVA PADRÃO PARA QUANTIFICAÇÃO DE SUBSTANCIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

Departamento de Bioquímica - CBS01004 - Bioquímica I

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

PRÁTICA 2 - MÓDULO 2

MÉTODO DE CURVA PADRÃO PARA QUANTIFICAÇÃO DE SUBST NCIAS

Matheus Lemos de Arruda

INTRODUÇÃO

O método de quantificação de uma substância desconhecida em uma amostra pode ser feito por curva padrão. Esse método colorimétrico se baseia na comparação da cor produzida na amostra desejada com a cor de uma solução de concentração já conhecida, chamada de padrão. A curva padrão corresponde a uma relação gráfica entre a quantidade e a absorbância e é usado quantidades crescentes da solução padrão para medir a absorbância.

MATERIAL E MÉTODOS

Parte 1: Determinação da quantidade de proteína pelo método biureto

Objetivo: Utilizar curva padrão para determinar quantidade de proteína em uma amostra pelo método colorimétrico de detecção do reagente biureto.

Material:

Tubo contendo amostra proteica 20 vezes diluída;

Padrão de proteína (5mg/mL);

Reagente Biureto;

Placa 96 poços.

Procedimentos:

Pipetar em triplicatas diretamente na placa de 96 poços a curva padrão seguindo os volumes da tabela:

Tabela 1: volumes a serem inseridos.

Pipetar 100 μL da amostra proteica em triplicata na placa. Acrescente em cada poço 200 μL do Reagente Biureto. Incube a placa a 32º por 10 minutos. Prossiga para a medida da absorbância a 520 nm no espectrofotômetro.

Parte 2: Quantificação de fosfato inorgânico

Objetivos: Utilizar curva padrão de fosfato inorgânico (Pi) para quantificar tres amostra distintas de tres lagoas diferentes (A, B, C) de uma mesma bacia hidrográfica. Determinar a coleta mais próxima, intermediária e a mais longe.

Material:

Padrão de Pi (1μmol/mL);

3 tubos eppendorfs contendo as amostras A, B, C;

Ácido tricloroacético (TCA) 5%;

Molibdato de amônia 0,25% em ácido sulfúrico 0,5 N;

Reagente redutor;

EDTA 1 M;

9 tubos de ensaio;

Placa de 96 poços.

Procedimentos:

Nomear tubos de ensaio de acordo com as colunas da tabela. Pipetar os reagente conforme a tabela:

Tabela 2: tabela guia para preparação dos tubos.

Adicionar 200 μL do reagente redutor em todos os tubos. Incubar os tubos por 7 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 100 μL em cada tubo. Transfira 200 μL de cada tubo para um poço da placa (pipete em triplicata). Determinar a absorbância a 650 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para descobrir a quantidade de proteína da amostra original, depois de calcular a média das absorbâncias (figura 1), precisamos do fator de calibração médio:

FCM= FC1 + FC2 + FC3 + FC4 / 4

FCM = 1,200933605

Em seguida, basta calcular a quantidade:

Q= Abs*FCM

Q= 0,2733333333*1,200933605

Q= 0,3282 mg

Agora, para encontrarmos a concentração:

0,3282 mg em 100 μL = 3,282 mg/mL

Como a amostra original foi diluída, esta será a concentração final:

3,282*20 = 65,64 mg/mL

Poços

Absorbância

Média abs.

FC

Branco

0

0