A Produção de Lovastatina por Fermentação em Estado Sólido Utilizando Aspergillus flavipes

Produção de Lovastatina por Fermentação em Estado Sólido Utilizando Aspergillus flavipes (espécie de fungo)

• Lovastatina produzida por fermentação em estado sólido
• Diferentes substratos sólidos como trigo, farelo, bagaço, cevada, farelo de soja, farelo de gramas, resíduos de frutos e algumas de suas combinações, foram testadas para a produção de lovastatina
• Desses substratos, o farelo de trigo se mostrou o mais adequado
• A suplementação do substrato sólido com fontes externas de carbono, tais como sacarose e lactose e fontes de azoto tais como ureia, sulfato de amónio e nitrato de amónio inibiu a produção de lovastatina
• O efeito do tamanho de partícula, do índice de umidade e do pH do substrato foi também estudado
• O farelo de trigo com um tamanho de partícula entre 0,3 e 0,5 mm com um nível de humidade de 60% e pH 5,0 deu o maior rendimento de lovastatina
• A variação na produção de lovastatina com a profundidade do leito de substrato foi estudada

INTRODUÇÃO

• Hipercolesterolemia é o acúmulo de colesterol no plasma sanguíneo que causa a aterosclerose (bloqueio da artéria), levando à doença coronariana e ataque cardíaco.
• Fora do colesterol total do corpo, um terço vem da dieta e quase dois terço é sintetizado no corpo.
• As estatinas inibem competitivamente a enzima HMG-CoA redutase (enzima que essencial para a síntese de colesterol)
• A lovastatina, também chamada de mevinolina, foi a primeiro fármaco a ser aprovado pela FDA
• A mevastatina foi a primeira estatina a ser relatada como metabolito secundário, seguido mais tarde pela lovastatina
• Desde então, vários organismos como Aspergillus Terreus, Monascus ruber, algumas espécies de Penicillium e espécies Trichoderma foram encontradas para produzir lovastatina
• Processos de fermentação submersa tem sido realizados para a produção em larga escala de lovastatina utilizando Aspergilus terréus
• Nos últimos anos, os pesquisadores mostraram a fermentação em estado sólido (SSF) como potencial alternativa para a fermentação submersa, porque utiliza substratos econômicos (resíduos agrícolas), requer menos etapas de processamento e de down-streaming, utiliza menos energia e gera menos efluentes. Além disso, SSF tem maior rendimento do produto e oferece uma melhor estabilidade do produto
• Neste artigo, apresentamos os resultados do nosso estudo sobre a produção de lovastatina por fermentação em estado sólido utilizando resíduos como substratos.
• Este é o primeiro relatório sobre a produção de lovastatina por Aspergillus flavipes.

MATERIAIS E MÉTODOS

• Preparação do microorganismo e inóculo

• Foi escolhida uma estirpe mutante de A. flavipes BICC 5174 usada para a preparação de uma suspensão de esporos, que foi utilizada como inóculo ao longo do estudo

• Fermentação em estado sólido em placas de petri e reator

• Os experimentos foram realizados com diferentes substratos sólidos como farelo de trigo, bagaço, cevada, farelo de gramas, farelo de soja e resíduo de frutas (laranja e abacaxi) para verificar sua adequação à produção de lovastatina. Também foram experimentadas combinações diferentes destes substratos. Foram recolhidos cerca de 10 g de substratos sólidos secos exatamente pesados ​​em placas de Petri diferentes e manteve-se o nível de humidade a 60% em todas as placas
• Os meios foram cuidadosamente misturados e incubados a 30 ° C, numa incubadora com controlo de humidade durante 8 dias
• Todos os dias, uma placa de Petri foi colhida para analisar a perda de matéria orgânica (LOM) e teor de lovastatina
• Realizaram-se estudos em dois reatores diferentes - aeração forçada e aeração difusiva com farelo de trigo

• Tamanho de partícula, teor de umidade e pH

• Os experimentos foram realizados utilizando o farelo de trigo como substrato em quatro intervalos de tamanho de partícula diferentes e umidade (50, 60, 70 e 80%) mantendo todas as outras condições fixadas.
• Para estudar o efeito do pH inicial sobre a produção de lovastatina, adicionou-se H2SO4 ou NaOH ajustar o pH entre 3,0 e 10,0

• Suplementação com diferentes fontes de carbono e nitrogênio

• Foi estudado o efeito de diferentes fontes de carbono (sacarose e lactose) e nitrogênio (ureia, sulfato de amônio e nitrato de amônio) na produção de lovastatina (utilizando também farelo de trigo)

• Perda de matéria orgânica (LOM)

• Supunha-se que a perda de matéria orgânica é devida à formação de CO2 por atividades metabólicas fúngicas durante o processo de fermentação. Uma vez que não existe um método direto para a estimativa da biomassa na SSF, a LOM foi utilizada para expressar a biomassa e a atividade metabólica de forma indireta

• Estimativa de lovastatina

• A estimativa da concentração de lovastatina presente no material fermentado foi analisada por meio de HPLC

        RESULTADOS E DISCUSSÃO

• Um estudo detalhado da lovastatina por A. flavipes BICC 5174 por fermentação em estado sólido utilizando vários substratos diferentes com diferentes tamanhos de partícula e em várias condições de pH, umidade e aeração foi realizado para caracterizar o processo
• O objetivo deste estudo foi quantificar o fluxo do processo e determinar as condições adequadas para escala
• Inicialmente, foi estudado um perfil temporal da produção de lovastatina em placas de Petri de 100 mm utilizando farelo de trigo como substrato
• 6 dias de experimentos
• Maior produção de lovastatina observada: 8,64mg/g de sólido seco
• A perda de matéria orgânica seguiu uma curva típica de saturação, indicando sua relação com a formação de biomassa
• Com base nestes resultados, decidiu-se que os valores de lovastatina e LOM no dia 6 seriam os utilizados para determinar as outras condições do processo para a produção de lovastatina

[pic 1]

• Uma vez que uma das motivações para processos de fermentação em estado sólido é a vantagem económica que proporciona, foram estudados vários substratos sólidos residuais e as suas combinações para determinar se estes poderiam ser utilizados para formular um substrato comercialmente atrativo
• Os experimentos foram realizados com bagaço, cevada, farelo de gramas, farelo de soja e restos de abacaxi e laranja
• Farelo de trigo: rendimento ótimo
• Combinação farelo de trigo/cevada: dá pra comparar razoavelmente com a produção de lovastatina utilizando o farelo de trigo como substrato
• Farinha de soja: rendimento muito baixo de lovastatina
• Resíduos de frutas: produção fraca de lovastatina

[pic 2]

• Foram realizados estudos de suplementação de farelo de trigo com fontes inorgânicas de nitrogênio (fontes de ureia), NH4NO3 e (NH4)2SO4, e com fontes de carbono, sacarose e lactose
• Os resultados de ambos os estudos de suplementação mostraram que a produção de lovastatina a partir de farelo de trigo diminuiu em comparação com os experimentos de controle que foram realizados sem suplementação
• Assim, os resultados obtidos com a linhagem mutante concordaram com a literatura de que as condições de limitação de nitrogênio são favoráveis à produção de lovastatina, mas discordam dos relatos de que a lactose é favorável à produção de lovastatina

• A produção de Lovastatina por A. flavipes BICC 5174 é sensível ao pH
• Dependendo do pH da água utilizada para manter o teor de umidade
• A produção de lovastatina mostrou um máximo seco de 12,98 mg/g a pH 5,0.
• Foram usadas partículas de tamanho P4 neste experimento

• A superfície de resposta para a produção de lovastatina e LOM foi obtida para teor de umidade entre 50-80% e tamanhos de partícula P1, P2, P3 e P4
• O valor do tamanho de partícula utilizado nos cálculos foi tomado como a média do maior e menor tamanho de partícula nessa gama. Por exemplo, o tamanho médio de partículas de P4 (tamanho variando entre 0,3 e 0,5 mm) foi feita como 0,4 mm nos cálculos
• Previu-se um máximo de 12,54 mg g-1 de sólido seco para um tamanho de partícula de 0,44 mm e um teor de humidade de 65%
• De uma perspectiva prática, o tamanho de partícula de 0,44 mm será difícil de obter porque as diferentes gamas de tamanhos de partículas P1, P2, P3 e P4 foram obtidas utilizando malhas padrão para rastreio. A previsão de lovastatina para um tamanho de partícula de 0,40 mm (partículas P4) a 65% de humidade era mais relevante do ponto de vista da aplicação.
• Obteve-se uma previsão de 12,52 mg de lovastatina g-1 por grama de sólido seco
• Em experimentos atuais conduzida a esta condição em placas de Petri, a produção lovastatina foi 13,49 mg g obtido como sólido seco
• Essa variação entre os valores previstos e reais pode ser atribuída a vários fatores: como a variação na amostragem, erros nos métodos gravimétricos e ausência de homogeneidade na matriz de substratos sólidos

[pic 3]

• A predição de LOM para um tamanho de partícula de 0,40 mm e 65% de humidade foi obtida como 36,7%
• Um LOM superior a 30% é indicativo de crescimento fúngico que é quase completo
• Assim, a produção máxima de lovastatina é obtida no momento em que o crescimento do fungo no substrato é também saturado. As amostras tomadas para estes pontos experimentais também mostraram um crescimento denso do fungo em toda a matriz de substrato

[pic 4]

• Existem dois efeitos opostos do tamanho de partícula na fermentação em estado sólido a qualquer teor de humidade dado. O primeiro efeito é o aumento da área superficial para o crescimento do fungo com diminuição do tamanho de partícula. A segunda é a redução no volume vazio e, portanto, a transferência de oxigênio em fase gasosa com diminuição do tamanho de partícula. A sobreposição destes dois efeitos é a redução da área superficial e do volume vazio devido ao crescimento do fungo durante o curso da fermentação
• Para estudar esses efeitos, foram realizados estudos de aeração forçada em reator de 2L e aeração difusiva em frascos de vidro de 5L
• As experiências de aeração difusiva mostram que na profundidade do leito de 16 cm não se observou produção ou crescimento de lovastatina
• A profundidade do leito de 10 cm pode ser considerada como a profundidade crítica para a transferência difusiva de oxigênio para se tornar limitante na fermentação em estado sólido

[pic 5]

• Os resultados das experiências de aeração forçada indicam aproximadamente a taxa máxima de fluxo de ar que deve ser usada para um determinado carregamento de farelo de trigo
• Usando um carregamento de 200 g no reator de 2L, a taxa de fluxo de ar tende a saturar a cerca de 2 vvm (volume de ar por volume de meio, por minuto)
• A curva pode ser interpretada como a resposta da produção de lovastatina por A. flavipes à aeração
• A produção máxima de lovastatina de cerca de 16,65 mg g -1 de sólido seco foi obtida.
• Este resultado foi obtido quando a bioconversão de farelo de trigo foi realizada nas condições optimizadas de pH 5,0, tamanho de partícula 0,4 mm, teor de humidade de 65% e taxa de fluxo de ar de 2 vvm.
• A partir destas experiências, a taxa de fluxo de ar para uma produção de lovastatina mais elevada foi determinada como sendo 1 vvm. No entanto, este resultado não é linearmente traduzível para escalas maiores de operação

[pic 6]

        CONCLUSÃO

• A maior produção de lovastatina 16,65 mg g-1 sólido seco foi obtido no biorreator de 2L, com agitação intermitente e a taxa de fluxo de ar 2vvm.
• As condições no reactor como previsto a partir da resposta de superfície e outras experiências foram pH 5,0, teor de humidade de 65%, taxa de fluxo de ar de 1 vvm e farelo de trigo de tamanho de partícula de 0,44 mm. Todas estas condições foram utilizadas exceto que foram utilizadas partículas de P4 (tamanho variando de 0,3 mm a 0,5 mm) de farelo de trigo em vez de partículas de 0,44 mm.
• Pode notar-se que a taxa de fluxo de ar utilizada para a produção de lovastatina mais elevada também teria de ser restrita a reatores de escala de bancada uma vez que esta taxa seria demasiado elevada para ser mantida em reatores maiores
• Os resultados aqui apresentados dão uma ideia básica das limitações e dificuldades que se enfrentam no desenvolvimento da fermentação em estado sólido para a produção de lovastatina por A. flavipes.
• Uma abordagem para resolver alguns dos problemas e uma tentativa de definir parâmetros que devem ser considerados na produção e no aumento da escala foram indicados

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