Os protocolos de extração de DNA genômico consistem de cinco etapas básicas

1. Extração de DNA genômico

Vários protocolos de extração de DNA tem sido descritos na literatura. O que se observa são protocolos padrões com poucas modificações de acordo com a necessidade de resolver problemas referentes a espécies estudadas. Para organismos eucariontes normalmente se utiliza uma combinação de proteinase K, detergente, fenol, clorofórmio e etanol.

Os protocolos de extração de DNA genômico consistem de cinco etapas básicas:

1. Rompimento da membrana celular;
2. Ressuspensão do material em um tampão de extração contendo detergente, ácido etileno diamino tetracético (ETDA) e agente tamponante visando à solubilização de membrana lipoprotéica e desnaturação de proteínas, enquanto o DNA é protegido da ação de enzima de degradação;
3. A suspensão é submetida a uma extração com um solvente orgânico. Nesta etapa por centrifugação são formadas duas fases: um orgânica (proteínas, lipídeos e outras macromoléculas) e uma aquosa (DNA, RNA e alguns polissacarídeos);
4.  Adição de etanol na fase aquosa (precipitação do DNA);
5. Ressuspensão em tampão Tris-EDTA.

Material necessário:

• Água ultrapura
• Amostra
• Banho-maria a 65°C
• Clorofórmio
• Etanol 70%
• Etanol absoluto
• Jogo de micropipetas com ponteiras estéreis
• Microcentrífuga para tubos de 1,5 e 2 mL
• Tubos de polipropileno de 1,5 e 2 mL para microcentrífuga

Metodologia

Todos os procedimento são realizados em temperatura ambiente.

• Descongelar e homogeneizar as amostras de sangue;
• Pipetar 350 μL de sangue em um tubo de microcentrífuga de 2 mL;
• Remover o tubo do banho-maria acrescentar 500 μL de SDS 20% (Dodecil Sufato de Sódio) e homogeneizar a amostra por inversão e incubar a 65°C por 10 minutos em banho-maria;
• Adicionar 800 μL de clorofórmio e agitar em vortex vigorosamente. A porção líquida deve fluir livremente e a hemoglobina apresentar um aspecto de partículas cobertas de chocolate.

• Adicionar 400 μL da solução de precipitação protéica e homogeneizar em vortex, até a amostra tornar-se uniformemente viscosa;
• Centrifugar em velocidade máxima por 10 minutos;

• Pipetar a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga de 2 mL;
• Adicionar 1 mL de etanol absoluto em temperatura gelado e homogeneizar por inversão até formar um precipitado, o qual deverá ser visto entre 30 e 60 segundos;
• Se o precipitado não for visualizado, esperar mais 10 minutos;
• Centrifugar em velocidade máxima por 5 minutos;
• Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol 70% gelado;
• Centrifugar em velocidade máxima por 2 minutos;
• Desprezar novamente o sobrenadante. Centrifugar em velocidade máxima por 1 minuto;
• Remover resíduos de etanol com o auxílio de uma pipeta e inverter os tubos para secagem;
• Adicionar 100-150 μL de água ultrapura ou tris-EDTA para cada tubo e homogeneizar levemente;
• Incubar a 65°C por 5 minutos em banho-maria.

Verificação de pureza e quantificação de DNA

Os ácidos nucléicos absorvem luz a 260 ηm. Sabendo-se que, com o valor da absorbância a 260 ηm (A260) sendo igual a 1, a concentração de DNA fita dupla corresponde a 50 μg/mL. Dessa forma, a concentração de DNA pode ser obtida por meio da fórmula:

DNA (μg/mL) = valor da leitura em A260 x 50 x fator de diluição.

As proteínas absorvem luz a um comprimento de onda de 280 ηm. Assim, a relação das absorbâncias a 260 e 280 ηm (A260/A280) fornece um parâmetro de avaliação da qualidade das purificações de ácidos nucléicos. Valores da relação A260/A280 inferiores a 1,8 ocorrem devido à contaminação por proteínas na amostra. Na presença de contaminantes, a leitura da concentração de DNA por espectrofotometria fica comprometida.

MATERIAL NECESSÁRIO

• Água ultrapura
• Amostras de DNA
• Cubetas de quartzo (desengorduradas e limpas com lenço de papel)
• Espectrofotômetro para luz UV
• Jogo de micropipetas e ponteiras
• Tubos de polipropileno de 1,5 mL para microcentrífuga

METODOLOGIA

• Ligar o espectrofotômetro 30 minutos antes da leitura (aquecendo a luz ultravioleta);
• Obter 500 μL de DNA diluído em água ultrapura a 1:50 (ex: 10 μL da amostra de DNA diluída em 490 μL de água ultrapura);
• Ajustar o comprimento de onda para 260 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;
• Efetuar a leitura da amostra diluída de DNA;
• Ajustar o comprimento de onda para 280 ηm e zerar o espectrofotômetro com 500 μL de água ultrapura;
• Efetuar a leitura da amostra novamente;

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Os dados abaixo exemplificam os resultados obtidos em uma leitura:

• Leitura da amostra a 260 ηm: 0,5
• Leitura da amostra a 280 ηm: 0,25

• Diluição da amostra: 1/100

A pureza da amostra será calculada pela fórmula: A260/A280: 0,5/0,25 = 2,0 que corresponde a uma amostra de boa qualidade.

A concentração de DNA é calcula pela fórmula: = valor da leitura em A260 x 50 x fator de diluição = 0,5 x 50 x 100 = 2500 μg/mL. Se o volume de amostra é de 100 μL, então a quantidade de DNA obtida é de 250 μg.

Extração de DNA Genômico pelo método Fenol-Clorofórmio

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