A Bioinformática Aplicada à PCR Específica

Bioinformática Aplicada à PCR específica

Idalina Adelaide Soares Carvalho

Escola Superior Agrária de Bragança, Campus de Santa Apolónia 5300-253 Bragança, Portugal

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Resumo: A Bioinformática pode ser definida como a “ aplicação de ferramentas computacionais para organizar, analisar, entender, visualizar e obter informação associada a macromoléculas biológicas”. É um dos pilares da investigação biomédica atual, ao nível das Ciências da Saúde e da Biotecnologia moderna, sendo cada vez mais indispensável no suporte a empresas e centros de investigação para diagnóstico precoce, o conhecimento de doenças complexas, o desenvolvimento e a análise da eficácia de fármacos, a melhoria de espécies animais e vegetais de interesse económico, entre outras. Métodos baseados em PCR também têm sido amplamente utilizados para a deteção de patogénicos porque são simples e rápidos em comparação com métodos convencionais baseados em cultura, devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento. O propósito deste trabalho foi estabelecer a relação da Bioinformática aplicada à PCR específica.

Palavras-Chave: Bioinformática, PCR, PCR específica, sequenciamento, DNA

Introdução:[pic 2]

Bioinformática:        

A Bioinformática é uma área da ciência que usa computadores para construir modelos das moléculas que compõe seres vivos. Isso envolve qualquer molécula, desde as moléculas de DNA das nossas células, proteínas, até mesmo a água existente no nosso corpo. Pode ser definida como a “aplicação de ferramentas computacionais para organizar, analisar, entender, visualizar e obter informação associada a macromoléculas biológicas” (Luscombe et al., 2001).

As técnicas de diagnóstico precoce, o conhecimento de doenças complexas, o desenvolvimento e a análise da eficácia de fármacos, a melhoria de espécies animais e vegetais de interesse económico, são alguns exemplos onde a contribuição da Bioinformática é de extrema importância para o sucesso final. Nesses modelos de moléculas, podemos descrever cada átomo, e como eles se ligam a outros átomos, formando uma (ou até milhões) de moléculas completas.

Para esse fim, a Bioinformática recorre a inúmeras plataformas e softwares de bases de dados com informações biológicas e de mapeamento. Apresentam um conjunto de dados e ferramentas de análises biológicas variadas, desde dados de expressão génica e informações filogenéticas

Bases de dados como a UniProt, que dispõe ferramentas de anotações de sequências de proteínas e estruturas 3D, ou o NCBI que se apresenta como uma biblioteca de sequências de DNA e RNA.[pic 3]

A partir destas plataformas é possível iniciar projetos de organismos geneticamente modificados (OGM), contruir proteínas ou ainda plasmídeos para terapia génica.

Outras ferramentas de apoio como a SEQtool ou o BioEdit, são utilizadas para análises básicas e avançadas de sequências de nucleótidos. No caso do BioEdit, este é um editor de sequências desenvolvido precisamente para permitir a edição e manipulação, e comprar múltiplos alinhamentos.[pic 4]

PCR:

PCR (reação em cadeira da polimerase) é a técnica de multiplicação de DNA, é usada em diversos segmentos, desde experiências e procedimentos em biologia molecular e pesquisa, à análise forense e diagnóstico médico. Para este procedimento é necessário componentes, como primers (DNA complementar) e a enzima DNA polimerase, responsável pela replicação.

Os primers são fitas de DNA complementar que se ligam ao início da sequência que se pretende multiplicar. São sintetizados quimicamente de modo a possuir uma sequência nucleotídica específica, previamente determinada de acordo com se sequências de DNA que se deseje amplificar.

A PCR permite que regiões alvo de pequenas quantidades de DNA sejam amplificadas exponencialmente, gerando quantidades maiores da região alvo. Essa reação pode ser adaptada para amplificar sequências específicas no DNA, conhecidas como sequências alvo (Nolan T. et al., 2013).

Metodologia:

Os compostos são colocados no tubo de ensaio e inseridos no Termociclador de PCR  que irá aumentar e diminuir a temperatura da amostra.[pic 5]

1. Desnaturação (95ºC): O DNA genómico que contém a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única;

2. Hibridização (60ºC): Após a separação das fitas, um par de iniciadores (primers) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência numa fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita (o molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita);

3. Extensão (72ºC): Com o molde já identificado, a enzima DNA polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA.

Este procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.

Métodos baseados em PCR têm sido amplamente utilizados para a deteção de patogénicos porque são simples e rápidos em comparação com métodos convencionais baseados em culturas. (Iversen et al., 2004).

Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração, as sequências genómicas de um grande número de organismos estão atualmente disponíveis no banco de dados GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Utilizando os dados e ferramentas da sequência do genoma fornecidos pelo NCBI é possível obter alvos moleculares específicos para diferentes patogénicos facilmente.

PCR Específica:

        A PCR Específica, também chamada de ARMS-PCR (amplification refractory mutation system), PASA (PCR amplification os specific alleles), AS-PCR, é utilizada para a deteção de SNPs (single nucleotide polymorphism).

SNPs são o tipo mais comum de variação genética entre as pessoas. Cada SNP representa uma diferença num nucleótido. Estas variações são encontradas no DNA entre os genes, podendo atuar como marcadores biológicos, ajudando a localizar genes que estão associados a doenças complexas ou rastrear a herança de genes de doenças nas famílias, como doenças cardíacas, diabetes e cancro.[pic 6]