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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS[pic 1][pic 2]

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

LICENCIATURA EM CIÊNCIAS: QUÍMICA E BIOLOGIA

Disciplina: Biologia Molecular

Docente: Welma Sousa Silva Carneiro

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA III

EXTRAÇÃO DE DNA DE MUCOSA BUCAL

Discente: Aderlane Laranjeira

ITACOATIARA/AM

2021

INTRODUÇÃO

Os métodos de extração de DNA são muito importantes pois permite que cientistas estudem o funcionamento das células e dos vírus. A partir do DNA extraído é possível realizar um estudo bem aprofundado, no qual lhes permitem detectar doenças, distúrbios e anomalias genéticas. Existem vários métodos para a realização desse procedimento, que vai desde os mais elaborados, realizados em laboratórios, até os métodos que são realizados com materiais de baixo custo. A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais: a lise das células presentes na amostra e a purificação do DNA. Após a lise das células, o DNA é separado dos restos celulares e das proteínas, é precipitado e suspenso em volume adequado de água ultrapura ou soluções-tampão adequadas. As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de purificação, com a finalidade de se obter melhores resultados nas amplificações

Segundo Mariane et al,. Diferentes amostras podem ser utilizadas para a extração de DNA, as mais comuns são, o cabelo, unhas, esperma, ossos, sangue, tecidos, saliva, cultura celular, urina e culturas de microrganismos (apud Correa et al., 2020). Para que seja realizado um diagnóstico de doenças genéticas e parasitarias a partir da análise do DNA, é preciso a coleta de amostra proveniente do paciente, as mais comumente utilizadas são o sangue periférico, material de biopsia e células da mucosa bucal. O estudo das células da mucosa bucal tem sido bastante realizado, por apresentarem a utilização de materiais de baixo custo. Porém, a baixa quantidades de células obtidas influencia no rendimento do DNA. É um método invasivo de coleta, geralmente obtida por raspagem das células epiteliais dessa região utilizando o swab bucal. A coleta de amostras de células da mucosa por meio de uso de swab bucal torna-se um método ideal para estes casos, visto que é uma abordagem mais segura, indolor, simples e eficiente, tornando-se um método excelente para obtenção de DNA de elevado peso molecular (Lima & Medeiros, 2015).

O método utilizado nesta prática foi adaptado, visto que se tratava da utilização de materiais de baixo custo. Os materiais e soluções foram escolhidas a fim de simplificar o procedimento, com ganho de tempo e ao mesmo tempo garantir uma amostra de DNA com qualidade suficiente com pureza e integridade para análises posteriores (Barea et al., 2004)

OBJETIVO

Apresentar o método de extração de DNA de mucosa bucal utilizando a solução de sacarose a 3%, com materiais de baixo custo. E comparar os protocolos com a extração de DNA de mucosa oral em laboratório.

METODOLOGIA

Essa prática foi realizada no laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) e utilizou-se materiais de baixo custo. Os materiais utilizados foram: 1 copo, 1 cotonete, 1 tubo de ensaio, 1 proveta de 15 ml, estante para tubo de ensaio, 1 micropipeta de 500μL, banho maria à 60°C e uma caixa de isopor com gelo. As soluções utilizadas foram: Sacarose a 3%, detergente neutro diluído a 25%, etanol absoluto gelado, NaCl 6M, e tampão TE.

Para a coleta do material a ser analisado, raspou-se a mucosa bucal com o auxílio de um cotonete, por 30 segundos. Colocou uma quantidade de solução de sacarose na boca e bochechou por aproximadamente 30 segundos. Depositou-se essa solução no copo e mergulhou o cotonete contendo a raspagem da mucosa bucal. Transferiu 15 ml da solução para a proveta (Fig 1A). Transferiu 5mL dessa solução contida na proveta, para um tubo de ensaio e adicionou-se 2,5 mL de NaCl 6M (Fig. 2A), e homogeneizou invertendo o tubo. Após essa etapa, adicionou-se 500μL de detergente neutro diluído a 25%, selou a boca do tubo de ensaio com o auxílio do parafilm e homogeneizou cuidadosamente (Fig. 3A). Levou-se para o banho maria e aqueceu a 60°C por 10 min (Fig. 4A), passado esse tempo, retirou-se do banho maria e resfriou por 5 min na caixa de isopor contendo gelo (Fig. 5A). Retirou-se do gelo e adicionou aproximadamente 1 cm de espessura de álcool gelado pelas bordas do tubo lentamente. Observou-se que o DNA insolúvel o álcool ficou visível. Retirou-se a solução contendo o DNA, e adicionou-se em 2 microtubos, levou para a centrifuga por 10 min (Fig. 6A). Retirou da centrifuga e descartou a solução, ficando na parede do tubo o que provavelmente seria o DNA (Fig. 7A). Acrescentou etanol e agitou-se o tubo até que o DNA se soltasse da parede, logo após, levou para a centrifuga. Descartou a solução e colocou os tubos para secar. Passado alguns minutos, adicionou aos tubos 100μL de tampão TE, levou para a centrifuga por alguns minutos, retirou da centrifuga, descartou a solução e colocou os tubos para secar (Fig. 8A).