Bioquimica

INTRODUÇÃO

Durante a eletroforese, a água é eletrolisada, gerando prótons no anodo e hidroxilas no catodo. O terminal catódico da câmara de eletroforese torna-se básica e a anódica acídica. O uso de sistema de tampão é, portanto requerido, quando moléculas carregadas são corridas por eletroforese em meio de separação. Os dois tampões mais comumente usados para eletroforese de DNA são Tris-Acetato com EDTA (TAE; 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e Tris-Borato com EDTA (TBE; 89 mM Tris-Borato, 2 mM EDTA). O pH desses tampões é básico, e portanto as moléculas de DNA com suas cadeias com grupos fosfato possuem carga líquida negativa, e migram para o catodo.

Apesar da aparente similaridade entre os tampões TAE e TBE, cada um possui propriedades específicas, que os fazem melhor adaptados para diversas aplicações.

O q são soluções.

PROTOCOLO DE PREPARO DE SOLUÇÃO – TAMPÃO T.A.E

Tampão T.A.E (Tris-Acetato-EDTA) é uma solução tampão usada em eletroforese em agarose, tipicamente para a separação de ácidos nucleicos tais como DNA e RNA, e é feito de tampão acetato da TRIS, normalmente a pH 8.0, e EDTA, os quais sequestram cátions divalentes. TAE tem uma mais baixa capacidade que T.B.E e facilmente pode se exaurir, mas DNA de dupla cadeia linear migra mais rápido em T.A.E.

Tampão TAE é usado tanto como um tampão de corrida como em gel de agarose. TAE tem sido usado em várias concentrações para estudar mobilidade de DNA livre com e sem cloreto de sódio. Métodos em eletroforese em gel em gradiente denaturado para análise de mutações em amplo espectro têm sido também descritos.

Tampão Aplicação e comentários

TAE Usar quando o DNA vai ser recuperado

Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 12 Kb)

Baixa força iônica

Propriedades:

Baixa capacidade tamponante - recirculação pode ser necessária para corridas eletroforéticas longas (> 6 horas).

Formulação

Tampão TAE (50x)

• 242 g TRIS base (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol) (= 2 moles)

• 57,1 ml ácido acético glacial

• 100 ml de solução de EDTA dissódico (Na2 EDTA) 0,5 M (pH 8.0)

• Água destilada até 1 litro

1Para preparar solução a 0.5 M de Na2 EDTA (pH 8.0) adicionar 186.1 g de etilenodiaminotetraacetato dissódico a 800 ml de água destilada. Agitar vigorosamente. Ajustar o pH a 8,0 com hidróxido de sódio, NaOH (aprox. 20 g de NaOH). Esterilizar por autoclavagem.

Observação. O sal dissódico do EDTA não irá permanecer em solução até o pH da solução ser ajustado a aproximadamente 8,0 pela adição de NaOH.

PREPARAÇÃO DE TAMPÃO T.A.E

Estoqie de 50X TAE (Tris-Acetato)

(1X= 40 mM Tris base; 40 mM ácido acético; 1 mM EDTA)

242,0 g Tris base

57,1 mL ácido acético Glacial

18,61 g Na2 EDTA2H2O

Completar para 1 litro com água destilada

PREPARO DO GEL DE AGAROSE (0,8%)

1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.

2. Adicionar 100mL de TAE 1X.

3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potência máxima – evitar fervura).

4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba.

5. Acrescentar 4µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve. Obs.: Brometo de Etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas. 6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.

7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. Obs.: Verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado.

8. Esperar a solução solidificar.

9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese. Adicionar tampão TAE

1X até cobrir a superfície do gel.

PROTOCOLO DE PREPARO DE SOLUÇÃO – TAMPÃO T.B.E

É uma solução tampão, contendo uma mistura de base Tris, ácido bórico e EDTA. Tampão TBE é preferido para a separação de moléculas pequenas de DNA (< 1 kb), quando a recuperação de DNA não é necessária. A interação do tampão TBE com a agarose resulta poros menores. Esse gel mais compacto reduz a expansão das bandas de DNA, causado pela dispersão e difusão.

Um tampão 0,5X TBE possui