Determinação de carboidratos
Por: Henric Kühn • 9/12/2015 • Ensaio • 389 Palavras (2 Páginas) • 923 Visualizações
4.1 PROCEDIMENTO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA AMILASE EM RELAÇÃO AO TEMPO DE INCUBAÇÃO.
1) Numerar 12 tubos de ensaio (de 0 – 11) e adicione 2 ml de água destilada em cada um deles,
em seguida adicionar 2 gotas de lugol a cada um desses tubos.
2) Numerar outros 12 tubos de ensaio(de 0 – 11), e adicionar 1 mL da solução cupro-alcalina a cada um deles.
3) Colocar em um copo de cafezinho/ béquer limpo 5 mL de amido 1% + 2 mL da solução tampão fosfato + 2 mL de NaCl 1% (SUBSTRATO TAMPONADO).
Transferir 2 gotas desta solução para o tubo número 0 da bateria contendo lugol e outras 2 gotas para o tubo número 0 da bateria contendo solução cupro-alcalina.
4) Adicionar 1 mLde solução de amilase salivar diluída 1:15 ao copo de cafezinho/becker (SUBSTRATO TAMPONADO) e agitar.
Neste momento se forma o SISTEMA DE INCUBAÇÃO. A partir deste momento marcar o tempo para incubação (1 minuto), realizado à temperatura ambiente.
5) Transferir 2 gotas do sistema de incubação para o tubo número 1 da bateria contendo lugol e outras 2 gotas para tubo número 1 a bateria contendo solução cupro-alcalina . Marcar 1 minuto.
6) Repetir a operação anterior em intervalos de 1 minuto entre cada um dos outros tubos das duas baterias até atingir o PONTO ACROMÁTICO nos tubos que contém lugol.
Ponto Acromático: é o tempo de incubação necessário para que todo o amido contido no sistema seja hidrolisado pela amilase, e portanto, no tubo correspondente a este tempo não mais se observa a coloração azul característica do amido em presença do lugol (a coloração é a do lugol).
7) Colocar os tubos contendo solução cupro-alcalina em Banho Fervente por 8 minuto.
8) Retirar os tubos do banho e esfriar em água corrente.
9) Adicionar a cada tubo 2 ml da solução fosfomolíbdica, e agitar.
10) Adicionar 5 ml de água destilada e agitar.
11) Ler as densidades óticas (Absorbância) a 480nm, acertando o zero com o tubo “Branco”.
12) Adicionar a cada tubo contendo lugol 5 ml de água destilada e agitar energicamente.
13) Fotografar os tubos das duas baterias de reação.
5. BIBLIOGRAFIA
DIXON, M. and WEEB, E.C. Enzymes, 2nd ed. Longmans. 1966.
VILLELA, G.G., BACILA, M, and TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica – Guanabara Koogan, 1973.
OSER, B.L. (ED.) Hawk’s Physiological Chemistry, 4th ed. Mc Graw Hill, 1965.
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