O Bacharelado Em Bioquímica Dosagem do Piruvato

Universidade Federal De São João Del Rei[pic 1]

     Campus Centro - Oeste Dona Lindu

   Bacharelado Em Bioquímica

Dosagem do piruvato

Divinópolis/MG

Setembro/2022

O piruvato é uma substância formada durante o processamento de carboidratos e de proteínas, e funciona como fonte de energia para as células. O mesmo é produzido pela glicólise no citoplasma, mas a sua oxidação só acontece na matriz mitocondrial nas células eucarióticas.

Para a prática de dosagem do piruvato utilizamos o método de alterar as condições fisiológicas através de um  pH alcalino, de modo a que a enzima funcione abaixo da sua atividade máxima, podendo ser inativada. Em soluções ligeiramente alcalinas ocorre uma acumulação de piruvato e a sua presença é demonstrada pela reação com a dinitrofenil hidrazina.

Diante disso, nessa prática utilizamos dois tubos que foram previamente preparados com 2,5 mL da suspensão de levedura em KH2PO4 (tubo A), e 2,5 ml da suspensão em K2HPO4 (tubo B), ambos com 2,5 mL de glucose adicionados. Os tubos ficaram em banho-maria a 37ºC durante cerca de 30 minutos, e após o banho  foram adicionados 1 mL de ácido tricloroacético (C2HCl3O2) , com o intuito de parar a reação. O conteúdo foi transferido para tubos falcon e logo em seguida, os tubos foram centrifugados durante 5 minutos à velocidade máxima (aprox.. 3.000 rpm). Foram identificados 3 tubos de ensaio: um para a amostra A, outro para a amostra B, e o terceiro para o piruvato, para cada um dos tubos A e B, foram adicionados 2 mL do sobrenadante da centrifugação e no tubo para o piruvato, foram adicionados 2 mL da solução de piruvato cuja a concentração é desconhecida.

Posteriormente,, foram adicionados 1 ml de solução saturada de dinitrofenilhidrazina em cada tubo, que foram agitados. Identificou-se novamente 3 tubos de ensaio, um para a amostra A, outro para B e outro para o piruvato, e em cada um desses tubos foram adicionados 3 gotas das soluções preparadas, em seguida, adicionou-se 1 mL de hidróxido de sódio (NaOH 10%) em cada tubo, juntamente com 5 mL de água, observou-se uma mudança na coloração das soluções, mudança que está descrita na Tabela 1. As soluções foram colocadas no espectrofotômetro e foram lidas as absorbâncias a 520 nm de cada uma das soluções e registradas na Tabela 1, para a leitura do branco no espectrofotômetro foram utilizados 3 gotas de HCl saturado com 2,4 dinitrofenilhidrazina, 1 mL de NaOH 10% e 5 mL de água.

Tabela 1: 

Tubo	Cor / Intensidade	Abs 520 nm
A
B
Piruvato

Para achar as concentrações desconhecidas, primeiro foi feito um gráfico de calibração a partir dos dados fornecidos no protocolo da aula.

[pic 2]

A partir da reta do gráfico, foi calculado as concentrações de piruvato desconhecidas.

Para encontrar as concentrações foram utilizadas as respectivas absorbâncias encontradas durante o experimento.

Piruvato (mM)	Abs
C	0,066
D	0,069
E	0,141

Cálculos:

Reta da curva de calibração: y= 0,0146 x+ 0,003 

1.  y= 0,0146 x+ 0,003 

0,066= 0,0146 x + 0,003