O Exercício de Genética

1. Griffith usou duas cepas de bactérias (Streptococcus pneumoniae) que infectaram ratos. As duas formas de pneumococcus, patogênica e não patogênica, são conhecidas como formas S (do inglês Smooth) e R (do inglês Rough), por causa do aspecto liso e rugoso, respectivamente, de suas colônias cultivadas em meio de cultura sólido. O primeiro, tipo III-S (lisas) são cobertas por uma capsula de polissacarídeos (composta por carboidratos e açucares que as protegem do sistema imune do hospedeiro). O segundo tipo de bactérias, tipo II-R (rugosas), não possuem a cápsula protetora, assim, são mais suscetíveis a serem mortas pelo sistema imune do hospedeiro. Essa bactéria é letal em ratos.  O primeiro passo foi inocular ratos com certa quantidade de bactéria encapsulada (S) viva. Logo, era de se esperar que estes ratos morressem após algum tempo. E foi isso que aconteceu. Outro grupo de ratos foi inoculado com bactérias não encapsuladas (R) vivas, não patogênico. O resultado obtido foi o esperado, ou seja, os ratos sobreviveram. Um terceiro grupo de ratos foi também inoculado com bactérias encapsuladas (S), só que mortas por calor, eles sobreviveram. No entanto, a inoculação de um quarto grupo de ratos com a mistura constituída de bactérias não encapsuladas (R) vivas e bactérias encapsuladas (S) mortas por calor causou a morte desses animais. Uma surpresa foi observando quando células vivas foram recuperadas dos ratos mortos, sendo que essas células originaram cepas lisas e eram virulentas após a injeção. Ou seja, de alguma forma, os restos das bactérias lisas mortas converteram as bactérias rugosas vivas em bactérias lisas vivas, definindo assim, o processo de transformação.

1. O princípio transformante foi explicado com base nas experiências de Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarthy, em 1944. A série de experimentos realizados consistiu em cultivos dos dois tipos da bactéria em placas com meio de cultura. Avery e os seus colaboradores extraíram os vários compostos químicos das bactérias de estirpe S mortas pelo calor e testaram a sua capacidade transformante isoladamente em bactérias de estirpe R.  O plaqueamento da forma não patogênica (não encapsulada) viva resultou na formação de colônias de bactérias com o aspecto rugoso característico não foi observado crescimento de colônias quando o plaqueamento do EXTRATO CELULAR do tipo patogênico (encapsulado) foi feito. Os pesquisadores, então, plaquearam uma mistura de células do tipo não patogênico com o extrato do tipo patogênico (Figura 2.2.c). Traçando um paralelo com o experimento de Griffith, neste caso, as colônias formadas tinham o aspecto liso característico das bactérias encapsuladas (virulentas), ou seja, algum componente celular foi capaz de transformar a bactéria não patogênica em patogênica.  Uma vez confirmado o “poder” de um extrato celular de bactérias patogênicas de transformar as características das células vivas do tipo não patogênico, restava descobrir o tipo de molécula responsável por esta transformação. Assim, foram feitos três outros experimentos de plaqueamento da mistura de bactérias não encapsuladas (tipo não patogênico) vivas e extrato de células de bactéria encapsulada (tipo patogênico), sendo que a cada um foi adicionado um tipo diferente de enzima, protease (enzima capaz de degradar proteínas); ribonuclease (RNase) (enzima capaz de degradar moléculas de ácido ribonucléico (RNA) e desoxirribonuclease (DNase) (enzima capaz de degradar moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA). Os pesquisadores esperavam que com esse experimento ocorresse a inativação das principais categorias das substâncias químicas presentes no extrato celular, uma de cada vez, buscando descobrir se o princípio “transformante” também estava inativado. E ocorreu o crescimento de colônias nas placas contendo RNase e protease; nenhuma colônia na placa contendo DNase. As colônias observadas nos meios de cultivo contendo RNase e protease demonstraram que RNAs e proteínas não eram responsáveis pela transformação, uma vez que, mesmo com a inativação desses compostos, a transformação do tipo não encapsulado no tipo encapsulado havia ocorrido. No entanto, o fato de nenhuma colônia ter sido observada na placa contendo DNase demonstrava que a degradação de moléculas de DNA havia impedido a transformação, sugerindo que o princípio transformante era o DNA. Além disso, quando a mistura contendo DNase foi aquecida a fim de desnaturar esta enzima, impedindo, assim, sua ação sobre o DNA, o princípio transformante não era afetado.
2. As experiências de Alfred Hershey e Martha Chase, publicadas em 1952, permitiram esclarecer estas dúvidas. Hershey e Chase usaram um vírus que infecta as bactérias (bacteriófago) partindo do pressuposto de que a infecção pelo fago envolveria a introdução de informação viral dentro da bactéria. A estrutura molecular do vírus é relativamente simples, sendo maioritariamente de origem proteica com DNA dentro da cápsula proteica. Investigadores sabiam também que as proteínas não possuem fósforo (P) nas suas constituições, mas que este elemento químico integra a estrutura do DNA, e que o enxofre (S) está presente nas proteínas mas não no DNA. Os fagos foram marcados com isótopos radioactivos 32P e 35S, separadamente e usados para infectar E. coli. Foram submetidos à agitação suave e centrifugação para separar as células de bactérias do capsídeo viral – que sedimentaram no fundo do recipiente – do sobrenadante com os restos virais (cápsulas dos fagos vazias). A etapa final consistiu em detectar a presença de moléculas marcadas radioativamente, com 32P ou 35S, em cada uma das frações. Quando mediram a radioactividade das duas fracções notaram que o isótopo 35S não se encontrava presente nas bactérias ao contrário do isótopo 32P, isto é, tinha ocorrido uma passagem do DNA do fago para o interior das células agora infectadas. Novas partículas virais foram produzidas e liberadas nos dois experimentos algum tempo depois das partículas vazias serem removidas, indicando que a mensagem genética, necessária para a replicação viral, havia sido introduzida na célula hospedeira pelo DNA viral e não por proteínas virais. Este experimento com o bacteriófago T2 corrobora o fato de que o material genético é o DNA, ou como parte do genoma de uma célula.

1. A descoloração da folha do fumo é causada pelo Vírus do Mosaico do Fumo (TMV) Fraenkel-Conrat e Singer realizaram experimentos para saber qual molécula guarda s informações genéticas, já sabiam que o TMV era constituído por RNA e proteínas. Estes dois pesquisadores utilizaram, então, dois tipos de vírus TMV: tipo A, constituído de RNA A e proteína A, e tipo B, constituído de RNA B e proteína B. Separadamente, as partículas virais foram degradadas de modo a separar a fração de RNA da fração de proteína. Em seguida, foram preparadas duas misturas: a primeira formada por RNA A e proteína B

e a segunda constituída de RNA B e proteína A, que foram posteriormente usadas para infectar lotes separados de folhas de tabaco. Após liberação de partículas virais, seus constituintes foram analisados. As partículas isoladas do lote de folhas de tabaco inoculado com a mistura (RNA A + proteína B) eram do tipo A, enquanto os vírus isolados

do lote de folhas de fumo inoculado com a segunda mistura (RNA B + proteína A) eram do tipo B. O experimento foi fundamental para se estabelecer que o material genético é sempre ácido nucléico, DNA ou RNA. Se preferir, podemos dizer que o material genético é sempre DNA, com exceção dos vírus de RNA, em que o material genético é o RNA.

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