Presença de Microroganismos no Ambiente

1. INTRODUÇÃO

É chamado de coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas. Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, está a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares.

Outro método de diferenciação é a detecção de quantidade de peptídeoglicano nas bactérias gram-positivas e nas bactérias gram-negativas. As bactérias gram-positivas serão violeta, enquanto as gram-negativas serão vermelhas. A estrutura que as bactérias irão apresentar é outro aspecto que pode ser levado em consideração para diferenciar as bactérias gram-positivas das gram-negativas.

O método de coloração de Gram é considerado um dos mais importantes dentro dos laboratórios de análises clínicas e microbiologia. Em laboratórios de análises clínicas, a técnica é essencial para obtenção de resultados.

1. OBJETIVO GEREAL:

Observar a morfologia das bactérias, fornecendo informações a respeito do comportamento do material celular diante de corantes básicos, bem como o grau de pureza de uma cultura bacteriana.

2.1) OBJETIVOS ESPECIFICOS

O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente, devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.

1. MATERIAIS

• 2 Estantes para tubos de ensaio.
• 1 caixa de lâminas para microscópio.
• 1 suporte por pia para coloração de lâminas.
• 2 alças de platina
• 2 bicos de Bunsen (Porem nessa aula foi utilizado lamparina)
• 1 caixa de fósforo.
• Microscópios
• 3 óleos de imersão
• Placas com cultura de bactérias (utilizadas amostras da aula 3)

3.1) MÉTODOS

Cada aluno utilizou a sua placa com cultivo de bactérias que foi feita na aula 3 (averiguação de presença de microrganismos no ambiente e na pele). Após esterilizou-se a alça de platina em um ângulo de 45 ºc na chama produzida pela lamparina até incandescer.

Foi realizado o preparo do esfregaço de culturas de bactérias da seguinte maneira: Pingou-se uma gota de soro fisiológico 0,9% na lâmina para ajudar a espalhar a colônia, após colocou-se uma gota de cada uma das colônias de cada cultura bacteriana sobre a lâmina de vidro, depois misturou-se gentilmente com o auxílio da alça. Fixou-se o esfregaço pelo o calor flambando rapidamente a lâmina. Após foi necessário esperar esfriar a lâmina para não ocorrer a cristalização do corante.

Já para realizar a coloração de Gram foi necessário: colocar o corante violeta de genciana sobre o esfregaço e deixar em repouso por um minuto, após escorrer o corante da lâmina adicionou-se a solução de lugol em quantidade suficiente para cobrir todo o esfregaço e esperou-se por mais um minuto. O terceiro passo foi escorrer o lugol da lâmina e em seguida lavou-se com agua. Foi necessário descorar o esfregaço utilizando álcool-acetona por 15 segundos. (Lembrando de não gotejar essa substancia diretamente sobre o esfregaço.) Por último foi necessário corar o esfregaço novamente com fucsina diluída e esperar mais um minuto, após lavou-se a lâmina com agua corrente e esperou-se secar.

1. RESULTADOS

Após a visualização no microscópio ótico observou-se a coloração e a morfologia das bactérias. Lembrando que a espécie da bactéria não foi observada pois teria que realizar um novo cultivo em outro tipo de placa.

Porem as bactérias observados segundo a sua morfologia foram cocos, seu arranjo seria circular e bem próximas como fossem cachos de uva, e sua coloração após o Gram foi a violeta indicando que a bactéria seria uma bactéria Gram positiva.

DESENHO 1:

1. ATIVIDADES

1. Descreva a estrutura e a composição da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

• As positivas possuem uma parede relativamente simples em estrutura, composta por várias camadas de peptidoglicano ligado uns aos outros por ligações cruzadas formando uma rede rígida e forte. Já as negativas possuem uma quantidade muito menor de peptidoglicano do que as Gram positivas mas apresentam uma membrana externa à parede celular.

1. Explique o fundamento da técnica da coloração de Gram. Qual a etapa crucial na execução da coloração de Gram.

• O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

1. CONCLUSÃO

O experimento foi satisfatório, de acordo com o que era esperado do mesmo, referente à função de cada composto utilizado, o corante Violeta tem afinidade por cargas negativas e o Lugol se associa aos cristais violeta. Ao se utilizar álcool na lavagem das placas, as células desidratam e o corante permanece dentro da mesma. Porém, isto não funciona com as bactérias Gram Negativas pois os corantes não são capazes de atingir o interior da célula, sendo assim, ao lavar, todo corante sai. Por este motivo não se foi utilizado álcool após a coloração com Fucsina, que é atraído por cargas negativas, se não as células não seriam coradas.