Produção de Células Competentes

[pic 1]	Biologia Molecular - Experimental  Aula 4
Profa. Isabel Cristina Braga Rodrigues [e-mail] CAP Sala 218 bloco 2

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

ATIVIDADE PARA AVALIAÇÃO – Franklin Rodrigues Carlos

1) Apresente a tabela de pipetagem da PCR executada pelo seu grupo. Vocês deverão elaborar uma legenda para esta tabela não esquecendo de citar a marca da enzima utilizada.

Tabela 1: Mix de PCR para Taq polimerase Sigma.

Componentes	[ ] estoque	[ ] de uso	1 reação (50 µL)	__ reações
Água, nuclease-free (ultrapura)	-	-	29 µl	87 µl
Tampão da PCR (Taq Buffer)	5x	1x	10 µl	30 µl
MgCl2	25 mM	1,5 mM	3 µl	9 µl
dNTP (mix)	10 mM	0,2 mM	1 µl	3 µl
Forward Primer	10 mM	0,4 mM	2 µl	6 µl
Reverse Primer	10 mM	0,4 mM	2 µl	6 µl
Taq DNA Polimerase	5u/ µl	5u	1 µl	3 µl
DNA (amostra)	-	-	µL*	-

Legenda: Tabela com concentrações de estoque e de uso típicas utilizadas no procedimento de Reação em Cadeia da Polimerase utilizando a enzima Taq polimerase da marca Sigma.

2) Apresente o resultado da PCR obtido pelo seu grupo (as fotos dos géis estão no portal didático). Edite a foto adequadamente para os resultados apenas do seu grupo, coloque o nome das amostras, as marcações do padrão e elabore uma legenda completa (pesquise em artigos, teses ou dissertações a forma de apresentar esse tipo de resultado). Posteriormente, escreva um breve parágrafo dizendo o que deu certo e possíveis explicações para o que deu errado.

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Figura 1: Visualização da corrida em gel de eletroforese 1,2% de agarose contendo o Padrão de Massa Molecular (MM) de 1kb da KASVI e as amostras: A, -A; F, -F; L. -L; M, -M; que não apresentaram o resultado esperado.

Sobre possíveis contaminações

A reação em cadeia da polimerase (PCR) e o gel de agarose são amplamente utilizados em laboratórios para análise e amplificação de material genético, como o DNA. Embora essas técnicas sejam muito eficazes, é importante ter em mente as possíveis contaminações que podem ocorrer durante esses processos.

Contaminações na PCR:

1. Contaminação cruzada de DNA: A contaminação de amostras com material genético de outras amostras é uma preocupação comum na PCR.

2. Contaminação com amplicons: Os amplicons são os produtos amplificados da PCR que podem ser transportados facilmente pelo ar. Esses amplicons podem contaminar outras amostras, reagentes ou superfícies, resultando em resultados falso-positivos.

3. Contaminação de reagentes: A contaminação de reagentes, como primers, enzimas e tampões, pode ocorrer durante o armazenamento inadequado, uso repetido de pipetas sem limpeza adequada ou contato com superfícies contaminadas.

Contaminações no gel de agarose:

1. Contaminação bacteriana: O gel de agarose é um meio propício para o crescimento bacteriano. Se o gel não for estéril ou se ocorrerem falhas nas técnicas assépticas durante a preparação ou manipulação, pode ocorrer a contaminação por bactérias. Isso pode levar à interpretação incorreta dos resultados ou à perda das amostras. É importante usar água e tampões estéreis, além de realizar o tratamento adequado do gel antes do uso.

2. Contaminação com DNA externo: A contaminação do gel de agarose com DNA externo pode ocorrer durante o carregamento das amostras ou pelo uso de ponteiras contaminadas. Isso pode levar a resultados falsos ou à detecção de bandas indesejadas.

3. Contaminação por corantes: Os corantes utilizados para a visualização das bandas de DNA no gel de agarose podem ser fontes de contaminação se não forem manuseados corretamente.

Quando ocorre contaminação na PCR, diversos problemas podem surgir, afetando a precisão e a confiabilidade dos resultados obtidos. Alguns dos principais efeitos da contaminação na PCR são:

1. Falsos positivos: A contaminação cruzada de DNA entre diferentes amostras pode levar a resultados falsamente positivos. Isso ocorre quando o DNA de uma amostra contaminante é amplificado erroneamente junto com a amostra alvo, levando à detecção incorreta de um determinado gene ou sequência.

2. Falsos negativos: Da mesma forma que a contaminação pode resultar em falsos positivos, também é possível ocorrer falsos negativos. Isso pode acontecer quando a contaminação inibe ou interfere na amplificação da sequência de interesse, levando à ausência de detecção, mesmo que o DNA alvo esteja presente na amostra.