Protocolo Preparação Amostras Biológicas para MEV

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PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS PARA MEV:

   Para obtermos boas imagens no Microscópio Eletrônico de Varredura,     devemos primeiro saber um pouco sobre a preparação dessas  amostras.

   A etapa mais importante neste processo é a fixação, é a primeira etapa, é quando se deixa principalmente a superfície do material o mais resistente possível.

   O fixador ideal para Microscopia Eletrônica de Varredura ou Transmissão é aquele que contém na fórmula o Glutaraldeído. A  escolha do fixador dependerá do pesquisador, do tipo de material que ele esta trabalhando, do tipo de técnica que usará para alcançar seus propósitos.

   O fixador faz com que o material fique exatamente como estava na forma viva, também deixará o tecido mais rígido, para que quando a amostra receba o feixe de elétrons ou passe pelo aparelho de  “ponto crítico” por exemplo, não ocorram danos na superfície, que para MEV é o  que interessa.

  Após a fixação o material é lavado em uma solução tampão, que serve para retirar o excesso de fixador. Após então, será  desidratado de uma maneira lenta e gradual. Na etapa em que o desidratante está puro (100%) podemos então levar as amostras para o aparelho de Ponto Crítico.

Dicas:

• Para uma boa fixação o volume de fixador deve ser  mais ou menos 5X o volume da peça.
• Ao manusear as peças procure tocá-las o mínimo possível, use de preferência um pincel que não solte pêlos ou uma pinça, sempre delicadamente.
• Quanto menor e mais plana a peça, melhor será a sua visualização ao MEV. Se for preciso diminuir ou limpar o seu material, faça isso de preferência na terceira lavagem do Glutaraldeído.
• As amostras depois de prontas devem ser mantidas longe de pó e principalmente de umidade. Utilize um dessecador para guardá-las ou uma caixa com sílica.

PROTOCOLO BÁSICO :

FIXAÇÃO:

Glutaraldeído  25%  ---------------------------  1,2ml

Tampão Fosfato 0,2M ------------------------   5,0ml

H2O destilada   --------------------------------    3,8ml

• A Fixação do material,  por imersão, deve ser feita imediatamente após a coleta. O período de fixação varia conforme a amostra. Sugere-se de no mínimo uma semana.

LAVAGEM:

Tampão Fosfato 0,2M  +  H2O destilada  Proporção de 1:1

-   O material deve passar por 3 lavagens (30min./cada).

DESIDRATAÇÃO:

Acetona   30%   ------------------------ 10min.

Acetona   50%   ------------------------  10min.

Acetona   70%   ------------------------  10min.

Acetona   90%   ------------------------  10min.

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