Purificação de Enzimas

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO

Teste – primeiramente faz-se uma análise quantitativa da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve ser isolada utilizando - se o teste de atividade em diferentes frações, sendo mais importante que a exatidão do método.

Procedimento Geral – definição da unidade enzimática, concentração e atividade específica.

Origem enzimática – determinação do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a rápida centrifugação adquire enzimas mitocondrial.

Extração – é necessário ter a enzima em solução e, portanto, a ruptura de membranas. Deve –se utilizar um tampão, pois ao romper o tecido pode ocorrer liberação de substâncias ácidas que degradam a enzima. Os métodos utilizados são o mecânico com partículas de areia, nitrogênio líquido, "shaker" em alta velocidade , ondas de ultrassom e solventes como acetona.

PURIFICAÇÃO BASEADA NA CARGA CROMATOGRAFIA

Definida como uma separação diferencial dos componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária. A fase estacionária é formada por partículas esféricas de um material insolúvel que é colocado (“empacotado”) numa coluna. A mistura de enzimas a serem separadas é introduzida pela fase móvel e forçada a migrar através da coluna. As enzimas que possuam maior atração pela fase estacionária irão migrar de forma diferenciada (fixar-se ou mover-se mais lentamente) daquelas que tem maior afinidade pela fase móvel. FASE ESTACIONÁRIA – matriz ou resina que pode ser modificada pela ligação de grupos químicos para conferir-lhe determinadas características físico-químicas adequadas a cada processo. MATRIZEZ MAIS COMUNS – celulose, dextrana, agarose, poliacrilamida, poliestireno e devem ter alta estabilidade química, mecânica e biológica.

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

Esta técnica envolve adsorção a grupos carregados da resina, seguida de sua eluição com fracionamento. ENZIMAS – carregam grupos ionizados em sua superfície, devido aos resíduos de aa. CARGAS POSITIVAS – devido a resíduos de histidina, lisina,arginina. CARGAS NEGATIVAS – são devidas aos ácidos aspártico e glutâmico e ao grupo carboxi C terminal.

O balanço de cargas depende das quantidades relativas desse grupos carregados e isso varia com o pH; quando esses grupos estão presentes em igual número, temos o pI (ponto isoelétrico). Acima do pI, a enzima possui uma carga negativa e abaixo uma carga positiva.

Por isso, há matrizes carregadas com grupos positivos como DEAE (dietilaminoetil) chamadas aniônicas ou trocadoras de ânions e com grupos negativos, como CM (carboximetil) chamadas de cátions ou trocadores de cátions.

Na seleção da resina adequada para a purificação de uma enzima, o pH de estabilidade desta enzima deve ser considerado para se determinar a faixa de trabalho.

Se a enzima é mais estável acima do pI, uma resina aniônica deve ser a escolhida e se a faixa de estabilidade for abaixo do pI, escolhe uma resina catiônica.

A fase móvel deve ser sempre tamponada de forma a minimizar flutuações de pH, o que poderia afetar as interações entre as fases móvel e estacionária.

PURIFICAÇÃO BASEADA NO TAMANHO PRINCÍPIO BÁSICO

É uma partição de moléculas entre solvente e uma fase estacionária de porosidade definida; é uma forma de cromatografia de partição para a separação de moléculas de diferentes tamanhos e tem várias denominações, como: - filtração em gel, cromatografia de exclusão em gel. O processo de separação é realizado utilizando-se uma matriz com porosidade controlada, empacotada numa coluna e envolta pela fase móvel. Quando se aplica uma amostra constituída de uma mistura de moléculas de diversos tamanhos, as moléculas menores irão penetrar nos poros da matriz e em razão disto, terão um movimento mais lento através da coluna, sendo os componentes eluídos ao final do processo de separação.

As moléculas maiores passam pela coluna juntamente com a fase móvel e são eluídas primeiro, já as de tamanho intermediário podem entrar no gel e são eluídas na ordem direta em relação ao tamanho, com as de menor PM saindo num volume de eluição menor. O volume em que a amostra é eluída chama-se volume de eluição (Ve) e o volume em que as partículas maiores que o poro são eluídas, ou seja, o volume da fase móvel, é chamado de volume de exclusão ou volume vazio (V0).

Ao volume do leito da coluna dá-se o nome de volume total (Vt). Para uma determinada partícula, as condições de eluição dentro de um determinado gel devem ser constantes, desta forma pode-se calcular um coeficiente chamado de coeficiente de partição (Kav) que é dado pela seguinte fórmula:

Kav = (Ve – V0) (Vt – V0)

A maioria dos suportes utilizados são constituídos de polímeros como dextrana, agarose e poliacrilamida.

A escolha do gel dependerá da finalidade a ser alcançada (quando se quer aumentar a resolução do gel se escolhe partículas menores).

Se o objetivo é a separação de moléculas grandes, como por exemplo enzimas, de moléculas pequenas como sais ou outros solutos com peso menor que 3000, géis com poros pequenos são utilizados. Nesse caso as enzimas são excluídas dos poros e são eluídas no V0. Géis adequados para esse fim são Sephadex G – 25 ou G – 50 (Pharmacia) e Biogel P – 6 ou P – 10 (Bio – Rad).

Os equipamentos para realizar uma filtração em gel incluem: coluna adequada, um detector de UV, um coletor de frações e um meio de controlar o fluxo