Relatório II - Microbiologia: Estriamento e Coloração de Gram

INTRODUÇÃO

Nos ambientes, existem diferentes microrganismos de diversos tipos e atividades fisiológicas. Para estudar um microrganismo em particular é necessário separá-lo do restante do meio em que se encontra. Para tanto, utiliza-se técnicas de isolamento que resultem em cultivo puro. Portanto, é importante realizar procedimentos que permitam o isolamento e seleção do microrganismo de interesse. [1]

A semeadura é um processo que consiste na inoculação de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer, podendo ser realizada em meio sólido ou líquido. A semeadura em placa de Petri é realizada através de estrias múltiplas para o isolamento, ou seja, por meio do estriamento. Esse método consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, visando obter um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra, podendo ser realizada em um sentido ou em vários, com o objetivo principal de realizar um isolamento bacteriano. [2]

Depois da incubação em que as bactérias se multiplicarão e formarão colônias, é realizada uma coloração de Gram. A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo bacteriologista Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884. Essa coloração permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos [3].

Essa técnica é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas [4]. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não conseguem reter esse corante.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de Microbiologia e de análises clínicas, sendo um dos primeiros passos para a caracterização de amostras de bactérias, pois muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em fluidos orgânicos. [3]

As bactérias são seres procariontes, ou seja, não apresentam seu material genético delimitado por uma membrana nuclear [5]. As suas paredes celulares são presentes e complexas bioquimicamente, apresentando peptidoglicano que é um polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias. [6].

Na maioria das bactérias Gram-positivas, a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicano, formando uma estrutura rígida. Além disso, contém ácidos teicóicos, que consistem primariamente de um álcool e fosfato. As paredes celulares das bactérias gram-negativas consistem de uma ou algumas camadas de peptideoglicana e uma membrana externa. O peptideoglicano está ligado a lipoproteínas na membrana externa e está entre a membrana externa e a membrana plasmática. As paredes gram-negativas não possuem ácidos teicóicos, mas sim lipopolissacarídeos (LPS) e fosfolipídio [4]. Ou seja, através da coloração de Gram é possível distinguir as bactérias Gram-positivas e as Gram-negativas por meio da observação de suas paredes celulares.

De forma resumida, na coloração de Gram as células gram-positivas retêm o corante e permanecem com a cor púrpura. As células gram-negativas não retêm o corante, ficando incolores até serem coradas novamente com um corante vermelho. Na imagem abaixo há um exemplo de coloração de Gram [7].

[pic 1]

Figura 1. Micrografia de bactérias coradas pelo Gram. Fonte: TORTORA, FUNKE & CASE (2012).

OBJETIVO

Desenvolver o método de semeadura e identificar bactérias como gram-positivas ou gram-negativas através da técnica de Gram.

MATERIAS E MÉTODOS

Para a realização do experimento, utilizou-se pipeta de Pasteur, alça de platina esterilizada, lâmina de vidro, prendedor de madeira como suporte para a lâmina, microscópio, bico de Bunsen, papel toalha, frasco de plástico para resíduos, água destilada, solução cristal violeta, lugol, etanol, safranina e cultura bacteriana feita pelo grupo.

Com o auxilio de uma pipeta de Pasteur, colocou-se uma gota de água destilada sobre a superfície da lâmina de vidro. Esterilizou-se a alça de platina no fogo azul do bico de Bunsen e utilizou-se a mesma para a coleta e homogeneização de uma alíquota da cultura bacteriana na água destilada inserida sobre a lâmina.

Fixou-se o esfregaço passando o mesmo várias vezes sobre a chama até que o líquido secasse. Cobriu-o com a solução cristal violeta e a deixou em ação por 1 minuto. Após o tempo, lavou-se delicadamente com água destilada. Adicionou-se ao esfregaço o lugol e aguardou 1 minuto, lavando-o com água destilada, assim como na etapa anterior, após o término do tempo. Inclinou-se a lâmina dentro do frasco de plástico e gotejou-se etanol 70%, lavando imediatamente com água destilada. Após esse procedimento, adicionou-se ao esfregaço a safranina, esperando o tempo de 40 segundos para sua ação. Lavou-se com água destilada e secou-se a lâmina com papel toalha sem esfregar sobre a amostra.

Observou-se o resultado no microscópio em todas as lentes objetivas, sendo elas com ampliação de 4x, 10x, 40x e 100x.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a encubação das duas placas selecionadas, obteve-se os seguintes resultados apresentados abaixo:  

[pic 2]

[pic 3]

Figuras 2 e 3. Desenvolvimento das colônias pelo método de estriamento (diluição 10-3 e 10-4). Fonte: Arquivo pessoal, 2018.

De acordo com a figura 2, a semeadura apresentou colônias bem distribuídas por toda a placa, permitindo seu isolamento. Esse fato é de extrema importância, pois revela que a colônia é pura e se trata de apenas uma bactéria. Pode-se observar uma colônia de coloração escura aproximadamente no centro da placa. Isso se deve a um erro de semeadura ou contaminação por conta dos participantes envolvidos na prática.