Curva Padrão

Relatório: Quantificação de Proteínas via Espectrofotometria

Aluno: Marlos Tacio Silva

Professor:  Dr. Humberto Reis Matos.

Introdução

As proteínas desempenham papéis importantes na maioria dos processos biológicos. O desenvolvimento de metodologias para quantifica-las é fundamental em várias áreas, como por exemplo, em análises clínicas, auxiliando no diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos. Os métodos para a determinação da concentração de proteínas são variados, entretanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta e no visível, conhecidas como UV-Vis.

Na espectrofotometria, um feixe de luz atravessa uma solução que contém moléculas que são capazes de absorver luz. Parte da luz incidente é absorvida, enquanto que o restante atravessa a solução, sendo detectada por um aparelho. Assim, é possível determinar a concentração do composto em solução, estimando a quantidade de luz absorvida. Geralmente, a absorção da luz ocorre em diferentes comprimentos de onda que variam entre  (ultravioleta) e  (infravermelho). Compostos que absorvem luz na faixa visível são naturalmente coloridos, mas mesmo aqueles que não absorvem luz no visível podem ser indiretamente detectados por reações químicas específicas que gerem produtos coloridos.[pic 2][pic 3]

A medida da absorção de luz pode ser definida pela lei de Lambert-Beer que define que quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada. Assim a absorbância pode ser expressa por:

[pic 4]

Onde:
 Coeficiente de extinção molar, ou a capacidade de absorver luz a um dado comprimento de onda
 Distância que a luz atravessa pelo corpo
 Concentração da substância absorvente[pic 5][pic 6][pic 7]

Objetivos

• Definir uma curva padrão para a quantificação de Albumina Bovina Sérica via Espectrofotometria pelo método de Bradford para determinação de proteínas
• Quantificar a concentração de uma amostra desconhecida a partir de uma curva padrão

Materiais

Reagentes

• Água destilada [pic 8]
• Reagente de Bradford
• Albumina bovina sérica
• Amostra de proteína com concentração desconhecida

Vidrarias

• Microtubos de [pic 9]
• Pipeta graduada de [pic 10]
• Micropipetas de , ,  e [pic 11][pic 12][pic 13][pic 14]

Instrumentos

• Balança analítica
• Espectrofotômetro

Métodos

Preparo da solução estoque

• Utilizando a balança analítica, transferir  de albumina para um microtubo[pic 15]
• Utilizando a pipeta graduada, transferir  de água destilada para esse microtubo[pic 16]

Preparo das soluções da curva padrão e da amostra desconhecida

• Utilizando as micropipetas e a pipeta graduada, preparar a solução padrão conforme a Tabela 1:

Tabela 1. Relação das medidas utilizadas no preparo das soluções para construção da curva padrão

Tubo	[Albumina] [pic 17]	Solução Estoque [pic 18]	Água [pic 19]	Reag. Bradford [pic 20]
B	0	-	1	1
1	10	10	1	1
2	20	20	1	1
3	50	50	1	1
4	70	70	1	1
5	100	100	1	1
6	150	150	1	1

• Utilizando as micropipetas e a pipeta graduada, preparar a solução da amostra de concentração desconhecida conforme a Tabela 2:

Tabela 2. Relação das medida utiizadas no preparo da amostra de concentração desconhecida

Tubo	[Proteína] [pic 21]	Amostra [pic 22]	Água [pic 23]	Reag. Bradford [pic 24]
D	?	50	1	1

Mensuração da absorbância das amostras com espectrofotômetro

• Utilizando o espectrofotômetro, ajustar o comprimento de onda para [pic 25]
• Utilizando o espectrofotômetro, inserir a cubeta com o branco e zerar a absorbância (A)
• Utilizando o espectrofotômetro, medir a absorbância de cada amostra padrão em ordem crescente
• Utilizando o espectrofotômetro, mensurar a absorbância da amostra de concentração desconhecida

Resultados Do Experimento

As medidas de absorbância de cada amostra estão sumarizadas na tabela a seguir:

Tabela 3.Relação entre a concentração de proteína e a medida de absorbância obtida

Tubo	[Proteína] [pic 26]	Absorbância [pic 27]
B	0	0,288
1	10	0,134
2	20	0,183
3	50	0,227
4	70	0,236
5	100	0,240
6	150	0,245
D	89	0,311

A curva padrão, obtida a partir da relação entre a concentração de proteína das amostras e das medidas de absorbância, está definida na Figura 1. Para a construção da curva foram utilizadas apenas as medidas de , 2 e , pois apresentaram uma maior linearidade. As demais medidas foram descartadas por não apresentaram um crescimento proporcional, tal problema deve ter sido causado por algum erro no preparo das amostras.[pic 28][pic 29][pic 30]

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