DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FUNDAMENTAIS E SOCIAIS ATIVIDADE ENZIMÁTICA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FUNDAMENTAIS E SOCIAIS

DISCIPLINA: Bioquímica Geral

PROFESSOR (A): Silvanda de Melo Silva

Relatório de Aula Prática:

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

MINISTRANTES DA PRÁTICA:   Allane Lucena

Mariany Cruz Alves da Silva

Luana Ferreira dos Santos

Raylson de Sá Melo

                Aluna: MARIANA DE VASCONCELOS DIAS - 31500126

        

AREIA-PB

SETEMBRO -  2016

1 – INTRODUÇÃO:

As enzimas são catalisadores proteicos que facilitam a ocorrência de algumas reações químicas aumentando sua velocidade, sem alterar sua composição. Por ações enzimáticas frutas e vegetais são deteriorados, e mesmo em baixa temperatura essa deterioração pode continuar.

A peroxidase é uma importante enzima das plantas e está envolvida em diversas reações, ligações de polissacarídeos, oxidação do ácido indol-3-acético, ligações de monômeros, lignificação, defesa de patógenos, cicatrização de ferimentos, etc. (GASPAR et al., 1982; KAO, 2003, citado por CAMPOS, et al., 2004). É uma das enzimas responsáveis pelo escurecimento em frutas, vegetais e seus produtos processados, por isso o controle das atividades da peroxidase é de grande importância durante a transformação dessas matérias primas para a obtenção de produtos processados (CLEMENTE; PASTORE, 1998) A enzima também pertence ao grupo enzimático das oxirredutases que oxidam substratos orgânicos, tendo o peróxido de hidrogênio como molécula aceitadora de elétrons. Devido a essa função oxidativa, sua ação pode resultar na alteração da cor, textura, sabor, aroma, além de contribuir na perda de nutrientes (BEAUDREAU,1966). A reação denominada peroxidação, pode ser descrita pela equação:

Xreduzida + H2O2 Xoxidada + H2O

Em que X é a molécula que sofre peroxidação.

Já o abacaxi (Ananas comosus), é uma infrutescência tropical produzida pela planta de mesmo nome, caracterizada como uma planta monocotiledônea da família bromeliáceas bromeliáceas da subfamília Bromelioideae, é um símbolo das regiões tropicais e subtropicais, bastante difundido e demandado no mercado mundial, nacional e regional e com uma produção mundial de 12,3 milhões de toneladas, em 1998, confere elevada importância econômica e social (SOUZA, EMBRAPA 2001).

2 – OBJETIVO:

Verificar a presença e o efeito da atividade da peroxidase na polpa do abacaxi (Ananas comosus), observando a velocidade de formação do produto em uma reação de oxidação em função do tempo de reação, em diferentes concentrações de substrato, assim identificando a velocidade máxima em função da concentração do substrato.

1. - MATERIAL E MÉTODOS:

3.1 - Materiais:

• Algodão
• Almofariz e Pistilo
• Bandejas
• Becker 250 mL
• Estantes para tubos
• Faca doméstica
• Bandejas
• Balança semi-analítica
• Material vegetal (Abacaxi)
• Pipetas (1 e 5 mL)
• Tubos de ensaio
• Funil plástico
• Espátulas
• Cubetas
• Banho de gelo
• Banho maria

Reagentes e Soluções:

• Água destilada
• Guaiacol 3%
• Peróxido de Hidrogênio 0,5 M
• Solução tampão fosfato de potássio (100 mM, pH 7,0) bem gelado

1. – Métodos:

Primeiramente é realizado o preparo do extrato enzimático, com o auxílio de um almofariz, foi adicionado 2g de amostra, logo em seguida é homogeneizado junto com 5 mL de tampão fosfato de potássio 10 mM com pH (neutro) gelado, contendo 0,1 mM  de ácido  etilenodiaminotetracético (EDTA). Após 1 minuto de maceração, a amostra é transferida para um tubo de ensaio, mas antes a solução é filtrada em um funil com algodão, e o conteúdo resultante é o extrato enzimático, que é mantido em um banho de gelo para que a enzima permaneça inativa.

Preparo das diferentes concentrações do substrato:

[pic 2]É utilizada uma solução de guaiacol à 12 molar, em seguida enumerados 7 tubos de ensaio em sequência, 17 – 33 – 83 – 167 – 250 – 333 e 500 µL da solução inicial de guaiacol. Depois é completado o volume dos tubos de ensaio para 1 ml, adicionando aos tubos de ensaio contendo o guaiacol, 983 – 967 – 917 – 833 – 750 – 667 e 500 µL de água destilada

Preparo da mistura de ensaio:

1 – Foram enumerados os 7 tubos de ensaio e transferidos 1,5 mL do tampão (fosfato de potássio) 100mM (pH 7,0) em temperatura ambiente, para cada tubo.

2 – Adicionou-se 0,1 mL da solução de guaiacol, obedecendo a ordem numérica (do primeiro tubo ao último, em sequência) em cada tubo.

3 – Foi acrescentado 0,2 mL da solução de peróxido de hidrogênio 0,5 M em cada tubo

4 – Por fim, foi adicionado 0,2 mL do extrato enzimático em um tubo de cada vez, que foram agitados e em seguida foi iniciada as leituras.

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Monitoramento da reação:

1 – O espectrofotômetro estava calibrado com água destilada à 470 nm

2 – Após a adição do extrato enzimático ao tubo, foi agitado e colocado na cubeta, onde foram anotados os valores de absorbância a cada 5 segundos durantes 30 segundos.