Estudo fisico quimico das proteinas

PROTOCOLO Nº 1 – Estudo Físico-Químico das Proteínas

1. Introdução

As proteínas, excluindo a água, são os compostos químicos mais abundantes nos organismos, com extrema versatilidade de conformações e funções. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto, torna-se importante a existência de métodos adequados de purificação e quantificação destes compostos. A purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se em suas características físico-químicas. Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 280 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reacções específicas com determinados reactivos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é baseado na reacção do sulfato de cobre em meio alcalino (reactivo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). O nome do método provém do facto de que a ureia aquecida a 180oC originar uma reacção positiva com desprendimento de amónia. Quando a substância contém duas ou mais ligações peptídicas, produz uma cor azul violeta com o reactivo de biureto. Esta cor desenvolvida é devida a um complexo entre o ião cúprico e duas cadeias peptídicas adjacentes.

As proteínas são macromoléculas coloidais, possuem uma camada de solvatação ou hidratação. Ao seu redor interagem moléculas de água, que permitem a sua solubilidade. Diversas substâncias, entre elas os sais inorgânicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem alterar a camada de solvatação de proteínas, aumentando (“salting-in”) ou diminuindo (“salting-out”) a solubilidade.

As proteínas possuem estruturas espaciais bem definidas que, segundo o nível de complexidade, podem ser caracterizadas como estruturas secundária, terciária e quaternária. Certos agentes podem alterar a conformação espacial original das proteínas, sem que ocorra alteração da estrutura primária, modificando, desta forma, algumas de suas propriedades biológicas. Este efeito, chamado de desnaturação, pode ser produzido pelo aumento da temperatura do meio, alteração do pH ou pela adição de solventes orgânicos. A alteração da estrutura primária das proteínas (quebra das ligações peptídicas) ocorre por tratamento à quente (100oC) em presença de ácido ou base forte ou através de adição de enzimas proteolíticas. Determinados agentes podem ser usados na precipitação de proteínas, o que é útil na desproteinização de materiais biológicos.

2. Objectivos

• Realizar reacção específica para detecção de proteínas (reacção do Biureto);

• Verificar a alteração de solubilidade de proteínas em presença de soluções salinas e solventes orgânicos;

• Verificar a acção de agentes desnaturantes;

3. Reagentes

• Reagente do Biureto: CuSO4 em solução alcalina.

• Solução diluída de proteínas.

• Solução concentrada de proteínas.

• Leite

• Solução de aminoácidos.

• Ácido tricloroacético (TCA ) 10% (P/V).

• Etanol gelado.

4. Procedimento experimental

• Enumerar 8 tubos de ensaio

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