O Crescimento Microbiano

Capítulo 2 – White

Rev. BMX

Crescimento microbiano é definido como aumento em massa celular de um cultivo microbiano. Uma vez que a medição direta da massa microbiana de uma cultura requer grande quantidade de células e ser um método demorado, o crescimento microbiano é muitas vezes estimado através da medição de outros parâmetros, proporcionais à massa celular da cultura. Dentre esses parâmetros destacam-se turbidez, contagem de células totais, contagem de células viáveis e peso seco e proteína.

        Turbidez: trata-se de um procedimento simples realizado em espectrofotômetro ou colorímetro, sendo usado rotineiramente por pesquisadores. O princípio baseia-se na quantidade de luz espalhada pelas células microbianas, que é proporcional a massa, e ao número de células. Na cultura mais densa, mais luz é espalhada e menos luz é transmitida. A medida é calculada pela Lei de Beer-Lambert:

I/Io = 10-xl

        I = luz transmitida (caminho da luz em centímetros)

        Io = luz incidente (caminho da luz em centímetros)

        x = densidade de células

        l = largura da cubeta

        I/Io = fração de luz incidente que é transmitida

Note que a fração de luz que é transmitida diminui exponencialmente com a densidade de células.

        Existe outra notação muito usada para expressar o crescimento medido por turbidez, que é dada por:

OD = A = Log(Io/I) = xl

OD = densidade óptica = A = absorbância

        Neste caso, OD e A, são diretamente proporcionais a massa da cultura.

        Contagem de células totais: pode ser realizada manualmente através de um microscópio, ou eletronicamente. Na contagem manual, uma gota da amostra com microrganismos é colocada sobre uma lâmina com vários poços quadrados de área e profundidade conhecidas. Em seguida coloca-se uma lamínula sobre a gota, e as células são contadas microscopicamente. Assim, o número de células por unidade de volume pode ser obtido, já que cada poço quadrado tem seu volume conhecido. Embora este seja um procedimento simples, possui duas limitações: não é possível distinguir células vivas de mortas, pode ser realizado apenas se a densidade de células for mais que 106 células/mL. A contagem eletrônica é um método mais sofisticado, no qual, as bactérias são suspensas em uma solução salina e colocadas em uma câmara com um eletrodo, separada de outra câmara com eletrodo também contendo solução salina. As duas câmaras são separadas por micro-poros. A solução com bactérias é bombeada e passa através dos poros para a segunda câmara. Sempre que uma bactéria passa pelo poro, a condutividade elétrica do circuito diminui. Esta variação resulta em um pulso de tensão que é contado eletronicamente. Neste tipo de contagem, o tamanho da célula também pode ser medido, porque é proporcional ao pulso.

        Contagem de células viáveis: a suspensão de células é diluída em série e em seguida colocada em meio sólido de crescimento. Cada célula viável dá origem a uma colônia. As colônias são então contadas.

Este método possui algumas limitações: estimará o número de células vivas se elas estão agregadas, já que cada agregado dará origem a uma única colônia; células únicas, poucas vezes darão origem a colônias; algumas culturas não crescem bem em superfícies.

        Peso seco e proteína: o peso seco é a forma mais direta de medir o crescimento microbiano em cultura de células. Primeiramente, as células são centrifugadas ou filtradas, em seguida são secadas até adquirirem um peso constante, e são pesadas cuidadosamente. No método de medição de proteínas as células podem ser filtradas ou centrifugadas. Muitas vezes elas são precipitadas com ácido ou álcool primeiramente, para depois serem filtradas ou centrifugadas. Um simples teste colorimétrico pode ser usado para medir a quantidade de proteínas. Este método possui a maior correlação com crescimento.

        Fases do crescimento de uma população microbiana

        Existem quatro fases de crescimento. A fase lag é a primeira, nela não ocorre crescimento, isto é, não há aumento em massa. Em seguida, as células entram na fase exponencial de crescimento, na qual a massa de células aumenta exponencialmente com o tempo. Após a fase de crescimento, a população entra na fase estacionária, onde não ocorre crescimento. Depois, as células morrem em um estágio final chamado de fase de morte.

        A fase lag ocorre geralmente, quando células em estado estacionário são transferidas para um meio novo. Há várias razões possíveis para a ocorrência da fase lag. Ela pode ocorrer devido ao tempo requerido para adaptação fisiológica de células que estavam em estado estacionário, preparando-se para crescer; ou devido ao tempo requerido para se recuperarem de produtos tóxicos de metabolismo; ou ainda, às vezes, novas enzimas e/ou coenzimas precisam ser sintetizadas antes da retomada do crescimento. A fase lag pode ser evitada se o inóculo, em fase exponencial de crescimento é tirado do meio e transferido para um meio novo de mesma composição.

        As células param de crescer e entram em fase estacionária por várias razões. Dentre elas estão, exaustão de nutrientes, limitação de oxigênio e acumulação de produtos tóxicos.

        A fase de morte pode ocorrer devido a ação de enzimas autolíticas ou depleção de energia celular. Algumas bactérias começam a morrer dentro de horas após o início da fase estacionária. Outras permanecem viáveis por um longo período. Isto ocorre porque algumas bactérias esporulam ou formam cistos quando o crescimento cessa. Esporos e cistos permanecem viáveis e germinam na presença de meio novo. Existem algumas bactérias que se adaptam a depleção de nutrientes e permanecem viáveis em fase estacionária por longos períodos mesmo sem a formação de cistos e esporos.

        É importante lembrar que mesmo após o fim da fase exponencial de crescimento, as células continuam a se dividir. Isto pode ser visto como uma vantagem para uma população de bactérias, pois mais células podem ser produzidas para uma distribuição para novos locais, onde as condições para a continuidade do crescimento podem ser melhores.

        

        Respostas adaptativas a limitações nutritivas

        Em ambientes naturais, as bactérias estão freqüentemente sob condições limitantes de nutrientes e entram em períodos intermitentes de pouco ou nenhum crescimento. Sendo assim, a condição normal de microrganismos em ambientes naturais é a fase estacionária. Existem várias respostas adaptativas para as limitações nutritivas.