O MÉTODO DE CURVA PADRÃO PARA QUANTIFICAÇÃO DE SUBSTANCIAS
Por: matheuslpb • 21/5/2019 • Relatório de pesquisa • 679 Palavras (3 Páginas) • 418 Visualizações
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
Departamento de Bioquímica - CBS01004 - Bioquímica I
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
PRÁTICA 2 - MÓDULO 2
MÉTODO DE CURVA PADRÃO PARA QUANTIFICAÇÃO DE SUBST NCIAS
Matheus Lemos de Arruda
INTRODUÇÃO
O método de quantificação de uma substância desconhecida em uma amostra pode ser feito por curva padrão. Esse método colorimétrico se baseia na comparação da cor produzida na amostra desejada com a cor de uma solução de concentração já conhecida, chamada de padrão. A curva padrão corresponde a uma relação gráfica entre a quantidade e a absorbância e é usado quantidades crescentes da solução padrão para medir a absorbância.
MATERIAL E MÉTODOS
Parte 1: Determinação da quantidade de proteína pelo método biureto
Objetivo: Utilizar curva padrão para determinar quantidade de proteína em uma amostra pelo método colorimétrico de detecção do reagente biureto.
Material:
Tubo contendo amostra proteica 20 vezes diluída;
Padrão de proteína (5mg/mL);
Reagente Biureto;
Placa 96 poços.
Procedimentos:
Pipetar em triplicatas diretamente na placa de 96 poços a curva padrão seguindo os volumes da tabela:
Tabela 1: volumes a serem inseridos.
Pipetar 100 μL da amostra proteica em triplicata na placa. Acrescente em cada poço 200 μL do Reagente Biureto. Incube a placa a 32º por 10 minutos. Prossiga para a medida da absorbância a 520 nm no espectrofotômetro.
Parte 2: Quantificação de fosfato inorgânico
Objetivos: Utilizar curva padrão de fosfato inorgânico (Pi) para quantificar tres amostra distintas de tres lagoas diferentes (A, B, C) de uma mesma bacia hidrográfica. Determinar a coleta mais próxima, intermediária e a mais longe.
Material:
Padrão de Pi (1μmol/mL);
3 tubos eppendorfs contendo as amostras A, B, C;
Ácido tricloroacético (TCA) 5%;
Molibdato de amônia 0,25% em ácido sulfúrico 0,5 N;
Reagente redutor;
EDTA 1 M;
9 tubos de ensaio;
Placa de 96 poços.
Procedimentos:
Nomear tubos de ensaio de acordo com as colunas da tabela. Pipetar os reagente conforme a tabela:
Tabela 2: tabela guia para preparação dos tubos.
Adicionar 200 μL do reagente redutor em todos os tubos. Incubar os tubos por 7 minutos em temperatura ambiente. Adicionar 100 μL em cada tubo. Transfira 200 μL de cada tubo para um poço da placa (pipete em triplicata). Determinar a absorbância a 650 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para descobrir a quantidade de proteína da amostra original, depois de calcular a média das absorbâncias (figura 1), precisamos do fator de calibração médio:
FCM= FC1 + FC2 + FC3 + FC4 / 4
FCM = 1,200933605
Em seguida, basta calcular a quantidade:
Q= Abs*FCM
Q= 0,2733333333*1,200933605
Q= 0,3282 mg
Agora, para encontrarmos a concentração:
0,3282 mg em 100 μL = 3,282 mg/mL
Como a amostra original foi diluída, esta será a concentração final:
3,282*20 = 65,64 mg/mL
Poços
Absorbância
Média abs.
FC
Branco
0
0
...