Quantificação de Carboidratos pelo Método do DNS

INTRODUÇÃO

Açucares redutores são carboidratos capazes de serem oxidados em soluções alcalinas. Essa possível oxidação é atribuída aos grupos carboxílicos/cetônicos existente na estrutura linear do carboidrato.

Essa característica redutora de alguns açucares nos confere a possibilidade de dosa-los quando inseridos em condições adequadas. Métodos de dosagem de açúcar são muito práticos e amplamente utilizados em indústrias de alimentos e para controles de qualidade.

Além da dosagem direta de açucares redutores, também podemos dosar dissacarídeos não redutores indiretamente. A sacarose, por exemplo, é um dissacarídeo não redutor formado por uma ligação glicosídica α 1,2 entre glicose e frutose (ambos açucares redutores). Desse modo, é possível dosar a quantidade de sacarose através de sua hidrolise.

Vários métodos de dosagem de açúcares redutores são conhecidos, nesta prática foi utilizado o método do DNS: 3,5 dinitro salicilato (Figura 01). Nesse método, a determinação é baseada em métodos colorimétricos, pois em meio alcalino o DNS é amarelo. Quando reduzido, entretanto, há a formação do 3 – amino – 5 – salicilato, que possui uma coloração laranja – avermelhado estável que possui absorbância máxima no comprimento de onda de 535 nm.

Vale ressaltar que o que é dosado é o DNS onde quanto maior a absorbância, maior a concentração de 3 – amino – 5 – salicilato na solução e, consequentemente, maior a concentração de carboidrato que foi oxidado. Portanto, para a dosagem desses açucares é necessário uma curva de calibração para que a relação de leitura no espectrofotômetro e concentração de açúcar seja direta.

Nessa prática, o método do DNS foi utilizado para dosar os açucares redutores (ar) e os açucares redutores totais (art) presentes no melaço, que possui em maior quantidade glicose (redutor), frutose (redutor) e sacarose (dissacarídeo não redutor). (Figura 02)

Figura 01 - Reação de redução do DNS. O monossacarídeo reage com o DNS em meio básico reduzindo-o, desse modo, o carboidrato é oxidado durante a reação.

OBJETIVOS

A prática teve como objetivo dosar os açúcares redutores existentes no melaço e a quantidade de açucares total (açúcares redutores + sacarose)

METODOLOGIA

Como já dito anteriormente, uma vez que o método utilizado foi o DNS, é necessário fazer uma curva padrão para quantificação do açúcar.

Para construção da curva padrão, foi preparada uma solução padrão de glicose 5μmol/ mL, adicionando-se 90mg de glicose a um balão e completando-se o volume com água destilada para 100mL. Adicionou-se, em tubos de ensaio com tampa, a solução padrão preparada, aumentando-se a quantidade desta progressivamente, como mostrado na Tabela 1.

Figura 02 - Açúcares a serem dosados. Em A está esquematizada a glicose; B está esquematizada a estrutura da frutose; em C temos esquematizada a sacarose – dissacarídeo formado a partir da ligação entre glicose e frutose.

Tabela 1 - Preparo de soluções para a curva padrão

Branco

H2O destilada (mL)

1,0

Solução padrão (mL)

-

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1 0,8

2 0,6

3 0,4

4 0,2

5 -

Adicionou-se 1mL de DNS a cada tubo, posteriormente incubando-os por 5 min em banho maria a 95oC. Após o resfriamento, foram adicionados 13 mL de água destilada em cada tubo, sendo esses tampados e homogeneizados em um vórtex. As leituras foram feitas em um espectrofotômetro com ajuste para comprimento de onda de 540nm.

Concomitantemente, foram feitos os procedimentos para dosagem de açúcares redutores e de açúcares redutores totais.

Vale ressaltar que o branco utilizado foi o mesmo branco usado na curva padrão.

Açúcares redutores

Foram diluídos 1 (A), 5 (B) e 7 (C) mL de caldo de melaço, em balões volumétricos de 100 mL. Pipetamos 1 mL do melaço diluído e transferimos para tubos de ensaio com tampa, devidamente identificados. Logo após, procedemos com a dosagem de açúcares pelo método DNS, onde foi adicionado 1 mL de DNS às amostras já colocadas nos tubos e levamos ao banho-maria por 5 minutos. Após atingir a temperatura ambiente, completamos com 13 mL de água destilada. Por estar muito diluída, para fazer a leitura das amostras, as mesmas precisaram ser diluídas. As amostras foram diluídas transferindo pra outros tubos de ensaio 7mL de cada amostra e adicionados 7 ml de água destilada em cada tubo. As amostras foram lidas no espectrofotômetro a 540nm. Apesar da diluição, as amostras B e C continuaram concentradas e foram diluídas novamente, ou seja, 7 mL dos diluídos de ambas amostras foram transferidos para outros tubos de ensaio contendo 7 mL de água destilada cada um. Os diluídos foram lidos no mesmo comprimento de onda e as absorvâncias anotadas.

Açúcares redutores totais

O melaço da cana de açúcar contém (em sua maioria) sacarose, frutose e glicose. A glicose e a frutose foram determinadas como descrito acima através do DNS. Por não ser açúcar redutor, a sacarose não foi quantificada acima.

Para isso, adicionou-se 10 mL do melaço em um balão volumétrico de 500mL, sendo adicionado posteriormente 70 mL de água destilada. A solução diluída foi colocada em balão volumétrico até atingir 65oC. Após atingida essa temperatura, o balão foi retirado do banho e adicionou-se, imediatamente depois, 25 mL de HCl 1:1; o ácido foi adicionado para hidrolisar a sacarose, levando a conversão aos seus monossacarídeos (frutose e glicose) que serão dosados. Após a adição do ácido, a solução foi homegenizada e deixada em repouso em temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse tempo, volume do balão foi completado com água destilada e a solução foi homogeneizada.

Foram transferidos respectivamente 2 (A), 10 (B) e 25 (C) mL da solução do balão para um novo balão,