Reação do Biureto - Prática

QUÍMICA EXPERIMENTAL

PRÁTICA 5: MÉTODOS PARA DOSAGEM DE PROTEÍNAS – REAÇÃO DE BIURETO

A formação de complexos corados em presença de CuSO4 em solução alcalina recebeu o nome de Reação de Biureto, por analogia à reação do composto Biureto, em mesmas condições experimentais.

O Biureto é o composto formado pelo aquecimento da uréia a 180ºC:

[pic 1]

Quando o Biureto é colocado em presença de CuSO4 em solução alcalina, obtém-se um composto de coloração azul:

[pic 2]

Este mesmo tipo de reação colorida ocorre com:

• Substâncias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou através de um átomo de nitrogênio ou carbono;
• Peptídeos que contenham no mínimo duas ligações peptídicas;
• Proteínas em geral.

Dependendo da complexidade da proteína e do peptídeo em questão, a cor do produto de reação na presença do reagente do Biureto (CuSO4 em solução alcalina) varia substancialmente: proteínas dão coloração violeta, peptídeos dão coloração rosa.

As estruturas cristalinas dos compostos formados são complexas, sendo que algumas já foram identificadas. Nas proteínas, acredita-se que haja a formação de um complexo de coordenação dos íons cúpricos com os elétrons não-ligantes do nitrogênio da ligação peptídica.

[pic 3]

A reação do Biureto pode ser utilizada para demonstrar a presença de proteínas em materiais biológicos, como também para quantificá-las, uma vez que o complexo Cu-proteína apresenta uma absorção máxima a 540 nm. No entanto, a intensidade da cor depende exclusivamente da concentração de proteína, já que as ligações peptídicas aparecem com a mesma frequência por grama do material a ser analisado.

Apesar de não ser um teste muito sensível (detecta 1 a 10 mg/mL de proteína), a reação do Biureto é largamente utilizada em dosagens rotineiras, pois está menos sujeita a interferência de contaminantes naturalmente presentes nas amostras biológicas.

PARTE EXPERIMENTAL

Material

• Solução padrão de caseína (10 mg/mL)
• Solução-problema (solução de caseína com concentração de 10 a 50 mg/mL)
• Reagente do Biureto: CuSO4 em solução alcalina
• Espectrofotômetro

Procedimentos

1. Construção da curva padrão para caseína

• Seguir o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de caseína (10 mg/mL):

Tubo	Solução de caseína (mL)	H2O (mL)	Reagente do Biureto (mL)	Abs (540 nm)	C (    )
B	0	1	4
1	0,2	0,8	4
2	0,4	0,6	4
3	0,6	0,4	4
4	0,8	0,2	4
5	1,0	0	4

• Após a adição dos reagentes, agitar e deixar reagir por 30 minutos à temperatura ambiente
• Realizar as leituras de absorvância a 540nm, usando o tubo B como o branco de reação.
• Lançar em um gráfico as leituras de absorvância x concentração.

1. Determinação da concentração de caseína em uma solução problema

• Calcule as diluições necessárias para que a dosagem seja realizada dentro da faixa de sensibilidade do método.
• Utilizando a curva padrão obtida, os mesmos reagentes e o mesmo espectrofotômetro, determinar a concentração de caseína em uma solução de concentração desconhecida, sabendo que a sua concentração está incluída na faixa de 10 a 50 mg/mL.