Caracterização do gene Erg11 em isolados clínicos e ambientais de C. gatti e C. neoformans com baixa susceptibilidade ao Fluconazol

RESUMO

Introdução: Criptococose é uma micose sistêmica e endêmica causada por leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus, sendo duas as espécies de interesse médico: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Os genótipos dessas duas espécies são de extrema relevância para o entendimento de sua natureza epidemiológica, bem como para compreensão da evolução deste microrganismo a um patógeno letal. A terapêutica base para Criptococose envolve o uso de três antifúngicos: a Anfotericina B,o Fluconazol e o Itraconazol, porém, devido ao número limitado de antifúngicos existentes, casos de resistência tem se tornado cada vez mais comuns, e o gene ERG11 pode estar envolvido neste processo, através das mutações que podem vir a ocorrer nas sequências nucleotídicas. Objetivos: Teve-se por objetivo caracterizar o gene ERG11 em isolados resistentes de C. neoformans e C. gatti. Como objetivos específicos propôs-se: identificar os grupos moleculares dos isolados ambientais e clínicos de Cryptococcus neoformans e C. gattii resistentes ao Fluconazol, identificar alterações no gene ERG11 que podem acarretar na resistência ao Fluconazol, e analisar a mutação do gene de resistência ERG11 nos isolados das espécies patogênicas. Métodos: Trata-se de um estudo analítico de corte transversal, realizado no laboratório de Micologia Clínica (FCF) e Imunologia Básica da Universidade Federal do Amazonas (ICB). Foram cultivados isolados clínicos e ambientais em Ágar Sabouraud, além de cepas de referência em Ágar Níger. Prosseguiu-se com análises de microdiluição em caldo, seguindo o protocolo M27-A3 da CLSI, afim de identificar isolados resistentes ao Fluconazol. A extração dos DNA’s dos isolados resistentes foi realizado com Kit QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany e submetidos a PCR-RFLP do gene URA5, análise em UV e comparação com as cepas de referência. Para a análise de mutações no gene ERG11, foram feitos PCR, sequenciamento e comparação das sequencias nucleotídicas dos genes dos isolados com amostra de referência obtida no banco de dados BROAD Institute. Resultados: foram cultivados 16 isolados ambientais, 15 isolados clínicos e 8 cepas de referência. Os testes de microdiluição apontaram 1 isolado ambiental e 1 isolado clínico resistentes ao Fluconazol. Foram obtidas quatro extrações de DNA’s do isolado ambiental e duas extrações do isolado clínico de concentrações 49 ng/μL e 55 ng/μL, respectivamente. A análise do gene URA5 revelou que ambos os isolados apresentaram como grupamento molecular o genótipo VGII da espécie C. gattii. Quanto à análise do gene Erg11, apenas o isolado ambiental expressou este gene, porém não foram identificadas diferenças nas sequências nucleotídicas da cepa de referência e do isolado resistente. Conclusão: O grupo molecular predominante encontrado nos isolados ambientais e clínicos resistentes foi o grupo VGII da espécie C. gattii. Os isolados clínicos não expressaram o gene ERG11 e análise da sequência de nucleotídeos das amostras ambientais não demonstrou nenhuma mutação neste gene, indicando que a resistência conferida a estes isolados se deve a outros mecanismos que não os expressos pelo gene ERG11.

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