Espectrometria de Fluorescência

A espectrometria de fluorescência ou também chamada de espectrofluorimetria, analisa a fluorescência de uma amostra. É um tipo de espectroscopia  eletromagnética, envolvendo o resultado da absorção de energia radiante e emissão de parte desta energia na forma de luz de baixa energia, mas não é necessariamente luz visível, é a luz que se dá pela excitação de elétrons nas moléculas de certos compostos, usando luz ultravioleta.

A fluorescência emitida é proporcional a concentração do composto analisado. Essa luz tem quase sempre seu comprimento de onda maior que a luz absorvida.

É um método muito caro e muito sensível, permitindo a analise de alguns metais que possam ser transformados em complexos orgânicos associados com íons ou quelatos  fluorescentes, como os corante fluoresceína, rodamina e seus derivados.

Os equipamentos que medem a fluorescência são chamados FLUORÂMETROS ou FLUORÍMETROS.

Esse método é muito usado nas analises de amostra de alimentos.

Outra técnica que complementa é a espectrometria de absorção.

A fluorescência e a fosforescência é um fenômeno definido como radiação emitida por espécies químicas  , que quando sofrem uma transição radioativa de um nível de energia excitada para outro nível de menor energia, isto é decorrente da interação entre a matéria com a radiação eletromagnética.

A diferença entre as duas se dá pelo tipo de transição eletrônica radioativa responsável pela desativação do estado excitatório.

Conhecido como luminescência, os fenômenos que envolvem a absorção de energia e sua posterior reemissão, emitindo radiação luminosa de uma substância quando aquecida.

Na fluorescência, a radiação emitida cessa, imediatamente depois da excitação. Na fosforescência, a emissão espontânea persiste durante intervalos de tempo longo (de segundos até minutos), retornando lentamente.

Sendo assim, a fluorescência é uma conversão da radiação absorvida em energia reemitida e a fosforescência envolve o armazenamento de energia e uma emissão lenta.

Átomos, íons, e moléculas podem ser excitados por dada quantidade definidas de energia, se certa quantidade de energia for aplicada no átomo, a mesma será absorvida por este, promovendo assim elétrons para camadas maiores de energia, podendo cair a níveis mais baixos assim emitindo radiação, no caso da espectrometria de fluorescência os átomos são excitados com luz.

A emissão de fluorescência (ou de fosforescência) pode ser seguida com um espectrofluorímetro. Neste caso escolhe-se um comprimento de onda de excitação, necessariamente onde a molécula absorva e recolhe-se a luz emitida aos diversos comprimentos de onda. No final representa-se a intensidade de emissão em função do comprimento de onda e obtém-se um espectro que se designa por espectro de emissão.

A intensidade total de fluorescência, F, é dada pela equação F = Ia Øf, onde Ia é a intensidade da luz absorvida e Øf o rendimento quântico da fluorescência. Uma vez que I0 = Ia  + Ip, onde I0 é a intensidade da luz incidente e It é a intensidade da luz transmitida, então:

F = (I0 – It)Øf  e uma vez que It = I0e-Ɛcl (lei de Beer-Lambert)

F = I0 ( 1-e-Ɛcl)Øf

No caso de soluções que absorvem fracamente, Ɛcl é pequeno, e a equação fica

F = I0 .2.3 ƐclØf  de modo que no caso de soluções muito diluídas (algumas PPM ou menos) a intensidade total da fluorescência F é proporcional à concentração da amostra e à intensidade da energia de excitação.

É instrutivo comparar a sensibilidade que pode ser conseguida pelos métodos de absorção e pelos métodos de fluorescência. A precisão global com que a absorbância pode ser medida não é certamente maior que 0,001 unidade quando se usam células de 1 cm. Uma vez que para a maioria das moléculas o valor de Ømáx é raramente maior que 105, a concentração mínima perceptível, com base na lei de Beer-Lambert, é dada por cmím > 10-3/10-5 = 10-8 M.

Com a fluorescência, no entanto, a sensibilidade está limitada em princípio apenas pela intensidade máxima da fonte de luz excitadora, de modo que em condições ideais, cmín = 10-12M.

Em geral o limite de detecção pela técnica da fluorescência é de uma ordem de grandeza 103 vezes menor que o limite de detecção pela espectrometria de absorção no UV.

As variáveis são aspectos, propriedades, características individuais ou fatores observáveis ou mensuráveis de um fenômeno. Elas podem ser classificadas de diversas maneiras, e uma dessas é a variação quantitativa. Todos os métodos precisam de potencia radiante, energia de um feixe de radiação que inicia uma determinada área. Na espectrofotometria os “máximos de absorção” são a principal diferença que se observa no espectro de substâncias diferentes.

As variáveis afetam a análise quantitativa dependendo da substancia e do espaço físico pela amostra, que também depende do tipo de instrumento que esta usando, dissociação, associação ou a solvatação.  Envolve o resultado da absorção de energia radiante e emissão de parte desta energia na forma de luz de baixa energia, normalmente, mas não necessariamente luz visível. A emissão de luz se dá pela excitação de elétrons nas moléculas de certos compostos, normalmente usando luz ultravioleta.

Tem possivelmente efeitos semelhantes sobre a fluorescência.