A Identificação de Gram +

PRIMEIRAMENTE: Coloração de GRAM.
Na placa, já com a bactéria fixada: Adicionar Cristal de violeta e deixar por 1min, escorre, adiciona Lugol, deixar por 1min, escorre e faz a lavagem com descorante bem RAPIDAMENTE e já lava (não lavar em agua com muita pressão), e por ultimo adicionar Fucsina e deixar por 30seg, lavar e deixar secar.

Analisar em microscópio se é COCOS.

Se cocos, então:

Teste da catalase, em um cartão teste ou lamina, coloca 1 gota de agua oxigenada + bactéria, e analisa se há produção de bolhas.

COCOS GRAM + -> CATALASE +

Teste da Coagulase: coloca em um tubo estéril 500microlitros de plasma de coelho + um pouco da bactéria, homogeneíza bem e deixa por 24h em TA e analisa a coagulação no dia seguinte.
Se coagulase + é S. aureus,  se coagulase – pode ser S. epidermidis ou S. saprophyticus.

Como saber se houve coagulase: deitar o tubinho e ver se está liquido ou se está com coágulo.

Staphylococcus gram + -> catalase + -> Coagulase +

Possivelmente: S. aureus 

Mais testes podem ser realizados, como por exemplo, o teste da DNAse e Ágar manitol.

Teste da DNAse: para inocular a bactéria em outra placa é necessário realizar o “caldo” dela, para depois transferir ela pra outra placa com ágar DNA, nesse caso faz apenas 1 risco no meio da placa e deixa encubar. No dia seguinte ao ver que a cultura cresceu, adicionar HCL sobre toda a colônia e ver se formou um halo transparente em volta. Caso tenha formado, DNAse + então confirma-se que é S. aureus. Se não formado, DNAse negativa.

Teste Ágar Manitol: pegar a bactéria do caldo também e fazer uma estria em ágar Mueller-Hinton, e deixar encubado. No dia seguinte analisar, se mudar a cor para amarelo, Manitol + então confirmado para S. aureus. Se ficar mais rosado então manitol -.

Staphylococcus Gram + -> Catalase + -> Coagulase –
Staphylococcus epidermidis x S. saprophyticos

Para diferenciar, necessário fazer o teste da novabiocina

• Dentro de um tubo estéril colocar solução fisiológica estéril + bactéria e homogeneizar até a turbidez ficar de acordo com o parâmetro. Pegar um pouco dessa solução com o swab, passar um pouco o swab pela borda do tubo para tirar o excesso de liquido, e esfregar o swab na placa Agar Muller Hinton. Como será apenas um teste, fazer apenas metade da placa. Esfregar o swab em três posições. Espera secar por 5min e coloca o disco com uma pinça, bem no meio. Se sensível é S. epidermidis se resistente S. saprophyticus.

COCOS GRAM + -> CATALASE –

Ao fazer o teste de Catalase e perceber que não formaram bolhas, tem-se que a catalase é negativa, sendo assim indicativo de Streptococcus.

Próximo passo, analisar hemólise em placa ágar sangue.

• a-hemolitico: forma um pseudo halo em volta da bactéria, chamado de hemólise parcial. Faz teste para resistência a optoquina (mesmo processo da novabiocina), se sensível então é S. pneumoniae, se for resistente Streptococcus sp.
• b-hemolitico: grande halo em volta da bactéria, hemólise total. Faz-se teste para resistência a bacitracina, se sensível então é S. pyogenes, para ter mais certeza, faz o teste de PYR (único strepto + para PYR é o pyogenes) se resistente faz o teste de Camp e se positivo pode ser S. agalactie.
  Teste de PYR: pega uma plaquinha que vem no kit, ela tem 4 campos, em apenas 1 com uma alça estéril colocar um pouquinho de água, pega a bactéria e passa ali também, pode ser com a mesma alça, aguarda 2min e pinga 1 gota do reagente de cor. Se mudar de cor (vermelho) então é positivo. Confirma então o S. pyogenes.
• Gama-hemolitico: não forma nenhum halo. Então faz o teste de Bile-esculina

O teste é realizado em um tubo já com um material preparado (igual na placa), nesse teste você pegará um pouco da bactéria e passará nesse material no fundo do tubo. Deixara para analisar no dia seguinte. Se ficar PRETO então o teste deu + (realizar o teste MTS) se continuar da mesma cor, amarelo ou amarronzado então é negativo, sendo então qualquer Streptococcus.

Ao mesmo tempo em que fizer o teste de Bile-esculina já faz também o teste MTS (método de tolerância ao sal) onde em um meio com NaCl 6,5% você vai adicionar um pouco de bactéria e deixar encubado, analisando os dois testes no dia seguinte. O MTS tem cor roxa, se no dia seguinte permanecer roxa então é negativo, indicativo de Streptococcus do grupo D. Porém se ficar amarelo então é positivo, indicativo de Enterococcus, caso queira confirmar, é possível também fazer o teste de PYR que dará positivo.

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