AULA PRÁTICA 6: ENZIMAS

AULA PRÁTICA 6: ENZIMAS

Parâmetros cinéticos da enzima invertase de Saccharomyces cerevisiae.

1. INTRODUÇÃO:

A invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose, produzindo glicose e frutose. Por definição, uma unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mmol de sacarose a glicose e frutose por minuto a pH = 4,6 e a 25°C. Como ambas as hexoses estão combinadas entre si, pelos seus respectivos grupos redutores, a sacarose não possui propriedades redutoras. Por este motivo é possível determinar a atividade da invertase, determinando-se a formação do açúcar redutor.

Uma grande quantidade de microorganismos produz invertase, contudo comercialmente é biosintetisada através da Saccharomyces cerevisiae, tradicionalmente conhecido e vendido como fermento de pão. Esta enzima também está presente no trato intestinal, sendo sintetizada pela parede do intestino delgado, com a função de completar a digestão da sacarose dos alimentos.

A invertase tem uma elevada atividade no intervalo de pH 3,5-5,5 com um pH ótimo em 4,5 e um máximo de atividade a aproximadamente 60°C. Esta enzima é utilizada principalmente na indústria alimentar onde a frutose é preferida em relação à sacarose, porque é mais doce e não cristaliza tão facilmente.

2. OBJETIVOS:

• Demonstrar experimentalmente o estudo da cinética enzimática, usando a invertase como exemplo;

• Avaliar a atividade enzimática pela formação de produtos;

• Verificar os efeitos do tempo, concentração de substratos e presença de inibidores sobre a atividade da invertase;

• Determinar Km da invertase.

3. OBTENÇÃO DA ENZIMA

Observação: Esse procedimento foi realizado anteriormente a aula.

Colocou-se meio tablete (7,5 g) de levedura prensada em um almofariz. Adicionou-se 2,5 g de sílica e 5 mL de éter etílico. Triturou-se bem e adicionou-se porções de 2 mL de água destilada, ainda triturando, até que completasse 16 mL de água. Deixou-se em repouso por 30 minutos. A seguir, centrifugou-se por 10 minutos a 2.000 rpm. A enzima invertase estava contida no sobrenadante.

4. CURVA PADRÃO DE GLICOSE-FRUTOSE

Uma solução contendo glicose (5 mmol/L) e frutose (5 mmol/L) será utilizada como padrão. Pipete alíquotas desta solução, colocando-as em tubos de ensaio, de acordo com a tabela abaixo. Complete o volume para 1,5 mL com água destilada. Em seguida, adicione aos tubos 1 mL do reagente de ácido 3,5-dinitrossalicílico (3,5-DNS) e coloque em banho de água fervente por 5 minutos, para o desenvolvimento da reação corada.

Obs: maiores informações sobre a reação de DNS serão vistas nas próximas aulas

Resfrie os tubos em banho com gelo e complete o volume para 7,5 mL de água destilada. Misture bem e faça a leitura de absorbância a 540 nm.

TUBOS

SOLUÇÃO DE GLICOSE-FRUTOSE (mL) ÁGUA DESTILADA (mL) ABSORBÂNCIA

(540 nm) GLICOSE-FRUTOSE (mol)

1 0 1,5

2 0,1 1,4

3 0,2 1,3

4 0,3 1,2

5 0,4 1,1

6 0,5 1,0

7 0,6 0,9

8 0,7 0,8

 Trace o gráfico de absorbância (ordenada) x mol de açúcares redutores (abscissa) e calcule o coeficiente de inclinação da reta e a equação da reta (demonstrar o r2).

5. ESCOLHA DA MELHOR DILUIÇÃO DA ENZIMA

Prepare uma série de tubos como indicado na tabela abaixo. Após adição da enzima (concentrada, diluída 2X ou 5X) em cada tubo, agite rapidamente e marque o tempo.

Incube a temperatura ambiente por 5 minutos. Interrompa a reação pela adição de 1 mL do reagente 3,5-DNS. Agite bem os tubos e coloque em banho de água fervente durante 5 minutos. Após o tempo retire e coloque os tubos em banho de gelo. Adicione 7,5 mL de água destilada, misture bem e execute a leitura da absorbância a 540 nm, como anteriormente.

TUBOS SACAROSE

0,02 mol/L (mL) TAMPÃO ACETATO

(0,05 mol/L, pH=4,7) (mL) INVERTASE (mL) ABSORBÂNCIA (540 nm)

Concentrada Diluída 2X Diluída 5X

1 0,5 1,0 - - -

2 0,5 0,8 0,2 - -

3 0,5 0,8 - 0,2 -

4 0,5 0,8 - - 0,2

 Escolha a melhor diluição da preparação enzimática (2 ou 5x diluída) para a realização dos próximos experimentos.

 Para os próximos experimentos preparar 10 mL da invertase na diluição adequada encontrada acima

6. CINÉTICA DE AÇÃO DA INVERTASE

Prepare os tubos de ensaio como indicado na tabela abaixo:

TUBOS TAMPÃO ACETATO

(0,05 mol/L, pH=4,7) (mL) IINVERTASE DILUÍDA (mL) TEMPO (MINUTOS) ABS

(540 nm) AÇÚCAR-REDUTOR FORMADO (mol) Velocidade inicial

(Vo)

1 1,0 - 0

2 0,8 0,2 1

3 0,8 0,2 2

4 0,8 0,2 3

5 0,8 0,2 4

6 0,8 0,2 5

7 0,8 0,2 6

8 0,8 0,2 8

9 0,8 0,2 15

Inicie a reação de cada tubo, com a adição de 0,5 mL de sacarose 0,02 mol/L e incube a temperatura ambiente por intervalos de tempo de acordo com a tabela acima.

Interrompa a reação com a adição de 1 mL de 3,5-DNS, tubo por tubo a cada tempo de reação.

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