Microscopia Métodos especiais

Técnicas Especiais:

1- Radioautografia:

A radioautografia é uma técnica em que é possível a localização de substâncias radioativas nos tecidos, esta baseia-se no efeito das radiações sobre as emulsões fotográficas. Nesta técnica cristais microscópicos de brometo de prata, contidos na emulsão fotográfica, agem como microdetectores da radioatividade; esses cristais atingidos pela radiação e depois de revelados transformam-se em grãos de prata metálica (aparecendo negros ao microscópio), caracterizando a presença de radioatividade nas estruturas que com este estão em contato.

Uma radioautografia é obtida da seguinte maneira: um corte de órgão, com o isótopo radioativo previamente injetado no animal, é posto em contato com uma película de emulsão fotográfica. Logo após, um certo tempo, a película é revelada e os pontos negros que nesta aparecerem vão corresponder aos locais do órgão que contêm o isótopo. Como a quantidade de grãos de prata é relativa à radioatividade presente, a radioautografia, permite que essa radioatividade também possa ser medida.

Essa técnica também foi adaptada para o uso em microscópios eletrônicos, onde a emulsão é colocada sobre os cortes finos de material embebido em resinas sintéticas; mas devido ao seu grande poder de aumento os grãos de prata em sua maioria não aparecem globosos, mas como filamentos enovelados.

Esse método tem sido largamente utilizado para o estudo de importantes fenômenos biológicos como pôr exemplos a síntese de proteínas e o metabolismo de D.N.A .

Então pôr definição de radioautografia obtemos que: “o uso combinado de moléculas radioativas e suspensões de brometo de prata em gelatina é a base de sua técnica”.

ILUSRAÇÕES:

2- Centrifugação fracionada:

Denomina-se centrifugação fracionada o processo físico que aplica a força centrífuga para separar organelas celulares, de acordo com o coeficiente de sedimentação de cada uma. Este depende do tamanho, forma e densidade da partícula e também da viscosidade e densidade do meio.

Fases da técnica:

• De início remove-se o órgão em estudo de um animal recém- sacrificado, esse órgão deve ser picados em pedaços muito pequenos e colocados em solução apropriada, como pôr exemplo sacarose e resinas plásticas solúveis e inertes de diferentes composições podem ser utilizadas para constituírem uns meios de viscosidades e densidades diversas.

• Logo em seguida, os fragmentos de órgão em suspensão são colocados em um cilindro de vidro onde dento gira em grande velocidade um êmbolo ligado a um motor elétrico, esse equipamento é denominado homogeneizador. Os fragmentos dos tecidos são atritados acabam liberando as organelas.

• Encerrado este processo deixa-se a suspensão em repouso pôr alguns minutos para que as células que ficaram intactas e as fibras do tecido conjuntivo possam se sedimentarem. Então inicia-se a centrifugação do sobrenadante com rotações cada vez maiores, sendo assim as organelas mais densas se sedimentam primeiro, e cada vez que o sobrenadante é submetido a forças centrífugas cada vez maiores obtem-se a separação dos diversos componentes celulares.

Um aperfeiçoamento deste tipo de centrifugação é a centrifugação contragradiente. O gradiente consiste em uma solução cuja concentração é máxima no fundo do tubo e mínima na superfície, apresentando um aumento gradual da concentração de cima para baixo. Sobre o gradiente homogeneizado celular e se faz a centrifugação. As partículas migram em direção centrífuga e param onde ocorre um equilíbrio entre a ação da força centrífuga e a tendência de flutuação da partícula. Essa técnica permite a obtenção de frações mais puras.

OBS.: todas as etapas de ambas as técnicas são realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas enzimáticos funcionem o que lesaria as organelas durante sua separação.

Ilustrações:

3- Imunocitoquímica:

Essa técnica tem como base o seguinte fato: quando uma macromolécula estranha (antígeno), é introduzida em um organismo, este reage produzindo uma proteína denominada anticorpo; que pôr sua vez combina especificamente com o antígeno. Nesta técnica podem ser utilizados marcadores acoplados a anticorpos, sem que este perca a capacidade de se combinar com o antígeno, para isso a técnica imunocitoquímica se divide em dois tipos: direta e indireta.

São 3 os métodos mais usados para marcar os anticorpos:

• Conjunção com composto fluorescente: esta técnica é possível devido a identificação do anticorpo e do antígeno a que ele se liga, pelo emprego microscópio de fluorescência.

• Conjunção com uma enzima: neste caso o anticorpo é localizado pôr meio de técnicas histoquímicas usualmente empregadas para enzimas. A mais utilizada é a peroxidase que pode ser visualizada tanto no microscópio óptico como o eletrônico.

• Conjunção com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispersa elétrons: o mais utilizado é o ouro pois suas partículas podem ser vistas tanto no microscópio óptico como no eletrônico.

Técnica direta:

Supondo-se de um determinado órgão de um certo animal possa se extrair e purificar quimicamente uma proteína, que será chamada de X (antígeno), deseja-se então saber em que célula ou estrutura do órgão que ela esta localizada, pois esta foi retirada de um órgão inteiro. Injetando-se a proteína X num coelho, este formara um anticorpo com propriedade de se combinar somente com ela. logo após um determinado tempo, do sangue do coelho, pode se extrair e purificar o anticorpo contra a proteína X. Este anticorpo pode ser ligado a um composto fluorescente podendo assim ser identificado ao microscópio.

Então mergulhando-se um corte do mesmo órgão do qual se obteve a proteína X numa solução que contenha o anticorpo marcado, haverá uma combinação dos dois e os componentes teciduais que contem a proteína X serão visíveis.

Técnica indireta:

Esta técnica é realizada pôr etapas:

• 1o etapa: faz-se a imersão do corte histológico em solução com