Métodos de coloração em hematologia

Laboratório de Ensino e Diagnóstico – Medicina Veterinária[pic 1]

Laboratório de Parasitologia

Protocolo

POP N° 18 MÉTODOS DE COLORAÇÃO EM HEMATOCITOPATOLOGIA

COLORAÇÃO DE WRIGHT

• Na preparação do corante, o azul de metileno é aquecido com bicarbonato de sódio, tornando-

o policromático. Pode ser adquirido em solução ou em pó. Pode-se dissolver, cuidadosamente, 1 grama em 600 mililitros de metanol.

• Outra fórmula: 0,3 grama do corante de Wright em pó + 3,0 mililitros de glicerina + 97, 0 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:

1. Coloque as lâminas na posição horizontal com as distensões ou imprints voltados para cima.

2. Cubra as distensões ou os imprints com a solução corante não diluída e deixe por 1 minuto. O metanol irá

fixar a distensão ou o imprint.

3. Dilua com água destilada (aproximadamente com o mesmo volume) até que uma espuma metálica apareça. Deixe o corante diluído agir por 2 minutos e meio a 5 minutos.

4. Sem deslocar a lâmina, enxágue com água destilada e lave até que as partes mais finas da distensão (esfregaço) ou do imprintfiquem róseas-avermelhadas. Percebe-se, usualmente, que a água destilada não dá

diferenciação adequada. Neste caso, tampão fosfasto (pH 6,4 a 6,5) (veja ao final as tabelas de tampão) pode ser usado, pelo menos na lavagem, e, possivelmente, também na diluição do corante.

COLORAÇÃO DE LEISHMAN

• O corante é preparado pelo aquecimento de solução aquosa de azul de metileno a 1% com carbonato de sódio (Na2CO3) a 0,5%, à 65oC, por 12 horas (tornando o azul de metileno policromático), após as quais é deixado amadurecer por 10 dias, antes de ser misturado com igual volume de solução aquosa de eosina B a 0,1%. Após esta mistura ficar descansando por 10 horas ela é filtrada e o precipitado é coletado e lavado com água destilada até não mais liberar cor. O precipitado é, então, seco e triturado até virar pó fino. Para fazer a solução corante uma pequena porção do pó fino é coletada com ponta de faca, bem amassada em 10 a 20 mililitros de metanol absoluto, e deixada precipitar (1 minuto); sendo o sobrenadante da solução alcoólica do corante filtrada em uma garrafa para estoque. Esta etapa é repetida até que 0,15 grama tenha sido dissolvidos em 100 mililitros de  metanol absoluto. Este corante melhora com a idade e não é satisfatório para o uso até que um mínimo de 3 semanas tenham passado, após a sua preparação. Adquirindo-se o corante em pó, pode-se prepará-lo no laboratório segundo a fórmula: 0,2 grama do corante de Leishmanem pó + 100 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:

1. É semelhante ao usado na coloração de Wright, exceto na etapa 3.
2. Com o corante de Leishman a diluição é feita com, aproximadamente, 2 volumes de água destilada para 1 volume de corante (o melhor controle é o aparecimento da espuma metálica). Se o tampão fosfato for requerido para a lavagem, use o com pH 6,8 que é o melhor. Este pode ser substituído por água destilada, durante a diluição do corante.

RESULTADOS:

1. Após a coloração, uma vez que as distensões (esfregaços), ou imprints, tenham atingido o grau de diferenciação desejável (usualmente em até 1 minuto), as lâminas são deixadas secarem.
2. A aparência dos elementos celulares é muito semelhante em ambas as colorações.
3. A coloração de Leishman pode dar mais contraste às estruturas nucleares.
4. Em ambas, as hemácias ficam róseas; os grânulos eosinófilos róseos-avermelhados brilhantes; os núcleos em tons variáveis do lilás ao púrpura; os grânulos neutrófilos na cor lilás.
5. Se as distensões, a olho nu, mostrarem-se róseas brilhantes, microscopicamente os eritrócitos devem estar vermelho-vívido, os grânulos eosinófilos róseos-pálidos brilhantes, e os núcleos fracamente azulados.

1. Estes problemas na coloração podem ser devido à acidez do corante ou ao tampão ou lavagem excessiva.
2. O corante de Leishman não amadurecido pode também dar núcleos pálidos. Por outro lado, se as distensões e imprints mostrarem-se, ao olho nu, azulados a violetas, microscopicamente os eritrócitos mostrarão uma tonalidade, variável, de marrom-acinzentada até púrpura; os grânulos eosinófilos serão cinza-metálicos e os núcleos e os grânulos dos neutrófilos mostrar-se-ão púrpura-escuros, sendo os detalhes obscurecidos.
3. As causas destes problemas podem ser uma excessiva coloração, pouca lavagem, ou corante ou lavagem muito alcalinos.
4. Lavar com solução tampão no pH 6,5 ou pH 6,8 pode melhorar a qualidade.
5. As distensões ou imprints recentemente corados, especialmente os pouco corados ou pálidos por terem sido muito diferenciados, podem ser descorados com enxágues em etanol a 95%, lavagem em água destilada, e novamente corados.
6. Deve-se ter em conta que os corantes de Wrighte de Leishman são misturas empíricas de corantes policromáticos, cujas bateladas podem variar. Também os processos de amadurecimento e policromização continuam na solução-estoque do corante. Se esta tornar-se contaminada com água, resultados ruins ocorrerão.
7. Para que estes sejam evitados recomenda-se que todas as distensões ou imprints sejam fixados com metanol absoluto, antes da coloração.

COLORAÇÃO DE GIEMSA

• O corante de Giemsa na realidade é mistura de azur II (mistura equimolar de azur I e azul de metileno) e eosinato de azur II (corante formado pela combinação equimolar de azur I, azul de metileno e eosina amarelada). Pode ser adquirido em solução pronta, ou ser feito segundo a fórmula: 0,3 grama de Giemsa em pó + 25 mililitros de glicerina + 25 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:

1. As distensões (esfregaços) ou imprints devem ser pré-fixados em metanol por 3 minutos.

2. Após secos, devem ser imersos na solução corante de Giemsadiluída (1 volume do corante em 9 a 15 volumes de água destilada ou de tampão fosfato no pH 6,8), em jarra de Coplin, e deixados por 15 minutos a 1 hora.

3. Após a coloração, devem ser lavados em água destilada e secas ao ar, sem montagem das lâminas.Este corante não é usado comumente sozinho, porém é excelente na coloração de corpos de inclusão (por exemplo, na conjuntivite por Chlamydia trachomatis), onde os esfregaços devem ser deixadoscorar na solução de Giemsa diluída por 12 a 18 horas.

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