Patologia

A MICROSCOPIA ELETRÔNICA

O microscópio eletrônico tem alta resolução e as imagens obtidas mostram uma riqueza de detalhes. Há dois tipos de microscópio eletrônico, o de transmissão e o de varredura.

1. Microscópio Eletrônico de Transmissão - Utiliza um feixe de elétrons em lugar de luz na produção de uma imagem. Os elétrons passam por uma bobina ou lente magnética, também chamada condensadora, que os dirige em feixe uniforme na direção do objeto, depois o feixe passa por outra bobina também chamada objetiva que forma uma imagem. Esta imagem é ainda ampliada por uma ou duas lentes que projetam (lentes projetoras) a imagem final sobre uma tela fluorescente ou um filme fotográfico.

Devido ao fato de serem os elétrons desviados facilmente pelo objeto, é necessário utilizar cortes muito finos de tecidos. A preparação das células para a microscopia eletrônica requer cuidado, é necessário usar fixadores que preservem ao máximo a estrutura. A fixação em geral é feita em solução de aldeído glutárico. Usa-se também a fixação em solução de tetróxido de ósmio. Na maioria das vezes os dois são empregados em seqüência: primeiro fixa-se o tecido em glutaraldeído e depois, em ósmio. O ósmio além de fixador, atua como contraste, por ser um elemento de número de massa elevado, que desvia os elétrons. As estruturas que combinam com o ósmio aparecerão escuras.

Além do ósmio, outros átomos são empregados para fixar e aumentar o contraste entre os componentes celulares, pois as diversas estruturas têm afinidades diferentes por esses metais. O contraste melhora quando mais de um deles é usado.

Para o exame no microscópio eletrônico, os tecidos devem ser incluídos em resinas mais duras, como as do tipo epóxi. Os cortes para o microscópio Eletrônico são feitos com navalhas de vidro ou diamante num ultramicrótomo. Ao contrário do método utilizado em microscopia óptica na qual a parafina deve ser removida antes da coloração, a preparação com plástico não exige remoção.

Criofratura - Um método especial de preparo da amostra para o MET, especialmente importante no estudo ultra-estrutural de membranas, é o método da criofratura. O tecido a ser examinado pode ser fixado ou não; se for fixado, o fixador é retirado por lavagem do tecido antes de prosseguir. O tecido é infiltrado com um crioprotetor, como o glicerol, e colocado para congelar rapidamente, até cerca de -71º C. A formação de cristais de gelo é evitada com o uso de crioprotetores, congelação rápida e tamanho extremamente pequeno da amostra do tecido. O tecido congelado é colocado no aparelho de criofratura. Este aparelho contém uma câmara no qual o tecido congelado pode ser mantido a vácuo, sendo em seguida fraturado, geralmente com um dispositivo para corte sobre um braço giratório. Na verdade o tecido não é cortado, mas fraturado ao longo de um plano que é aproximadamente o plano dispositivo de corte. Pode-se deixar o tecido fraturado no aparelho durante um período variável de tempo, mas curto, durante o qual a água congelada evapora, permitindo que certos detalhes estruturais sobressaiam em relevo. A amostra então é coberta (costumeiramente com platina) para se criar um molde sombreado. Fundamentalmente, a platina passa a ser uma réplica da superfície fraturada. O tecido é removido e a réplica da superfície, e não o próprio tecido, é colocada sobre a grade para ser examinada com o Microscópio Eletrônico de Transmissão. Tal réplica mostra detalhes em nível macromolecular.

2. Microscópio Eletrônico de Varredura - Este microscópio também utiliza um feixe de elétrons mas difere-se do MET pelo fato dos elétrons não atravessarem a amostra como parte do processo de formação da imagem.

O trajeto do feixe de elétrons é modificado por um conjunto de bobinas defletoras que o fazem percorrer a amostra ponto por ponto e ao longo de linhas paralelas (fazendo uma varredura). Ao atingirem a amostra, os elétrons causam diversos efeitos, entre os quais a emissão de elétrons secundários pelo próprio espécime. Os elétrons secundários são colhidos por um coletor, passam por um sistema de amplificação e são transformados em pontos de maior ou menor luminosidade num monitor de vídeo. As micrografias são obtidas pela fotografia da imagem no monitor na tela do computador, e não pela ação dos próprios elétrons sobre um filme fotográfico, como acontece no MET.

Geralmente, os espécimes não precisam ser cortados para serem examinados no MEV. Objetos de 1cm ou mais podem ser examinados inteiros.

O microscópio de varredura tem sido muito usado para o estudo da superfície de células mantidas em cultivo.

CITOQUÍMICA

A citoquímica estuda a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células. Pode ser aplicada em nível de microscopia óptica e de microscopia eletrônica. No primeiro, o produto da reação citoquímica deve ser corado e no segundo, deve dispersar elétrons.

Os métodos citoquímicos têm por base reações químicas específicas, ou a interação macromolecular de alta afinidade. Nos dois casos, o resultado final é usualmente, a produção de compostos insolúveis, corados, ou elétron-densos, que possibilitam a localização de substâncias específicas nos cortes de tecidos através do uso do microscópio óptico ou eletrônico.

Os lipídios são geralmente localizados por "corantes" que são mais solúveis nos lipídios do que no líquido em que o "corante" está dissolvido.

O ácido desoxirribonucléico (DNA) é demonstrado citoquimicamente pela reação de Feulgen, técnica que consiste em duas etapas, na primeira, mergulha-se a lâmina em solução aquosa de ácido clorídrico que promove a retirada das bases púricas e a formação de grupamentos aldeídicos na dexirribose, na segunda etapa, trata-se o preparado pelo reativo de Shiff, que, ao se combinar com os grupamentos forma um complexo de cor vermelha. Como a intensidade da cor vermelha que se forma é proporcional à concentração de DNA, ela permite o estudo quantitativo deste ácido nucléico. Esta técnica é específica para o DNA.

O estudo citoquímico do ácido ribonucléico (RNA) é baseado em sua basofilia (é demonstrado graças à sua acentuada afinidade pelos corantes básicos). Como o RNA não é a única substância basófila dos tecidos, é necessário incubar uma lâmina controle, antes de sua coloração, com ribonuclease, que digerirá o RNA presente. As estruturas que perdem a sua basofilia devido ao tratamento prévio com a ribonuclease contêm RNA.

O formaldeído reage com as catecolaminas