O DIAGNÓSTICO DE RAIVA -

DIAGNÓSTICO DE RAIVA - coleta

• O primeiro passo a se fazer é a coleta de amostra do animal suspeito. Deve ser realizada pelo médico veterinário imunizado ou por um assessor devidamente treinado e também imunizado.
•  O sistema nervoso central deve ser coletado e enviado ao laboratório de diagnóstico, em condições adequadas, para a confirmação de uma suspeita clínica. Nos cães e gatos deve ser coletado a cabeça inteira ou o SNC. Nos ruminantes deve ser coletado o encéfalo (cerebelo, córtex e tronco cerebral). Nos equinos deve ser coletado o encéfalo e a medula.
• A amostra deverá estar em condições de refrigeração caso a previsão de envio seja de até 24 horas. O laboratório de diagnóstico deverá receber amostras em bom estado de conservação, exemplo: com saco plástico duplo, lacrado ou frasco com tampa de rosca, resistente e bem fechado de maneira que não haja vazamento. Deve também estar devidamente identificado e colocado em isopor com gelo, para manter a refrigeração durante o transporte. Se o envio for entre 24 a 48 horas, a amostra deve ser congelada e embalada da mesma forma.
• Na embalagem externa, deve constar o nome do laboratório de destino, com seu endereço completo, bem como o órgão remetente e seu endereço. A amostra deve ser acompanhada de uma ficha de remessa com os dados epidemiológicos. (MINISTÉRIO DA SAÚDE – 2008)
• Materiais para coleta: Equipamentos de proteção individual: toucas/gorros; protetor facial; máscara; óculos de proteção; batas cirúrgicas; avental longo oleado, de borracha ou material similar; luvas de borracha com punho longo; botas de borracha.  (MINISTÉRIO DA SAÚDE – 2008)
•  Instrumentais: morsa para contenção adequada da cabeça do animal; bisturi; faca de dissecação; serra de arco e lâminas para substituição; cinzel; tesouras cirúrgicas de ponta reta e curva; pinças de dissecação (“dente de rato”); pedra de afiar. (MINISTÉRIO DA SAÚDE – 2008)[pic 1]

TECNICAS DE DIAGNÓSTICO OFICIAL (MINISTÉRIO DA SAÚDE – 2008)

• Existem duas técnicas oficiais: imunofluorescência Direta e a prova biológica – isolamento do vírus da raiva em camundongo.
• A técnica de imunofluorescência direta com utilização de anticorpos fluorescentes é método rápido, sensível e específico de diagnosticar a infecção rábica em susceptíveis.
• A prova se baseia na presença do vírus da raiva em impressões de amostras de SNC de animais suspeitos ou de tecidos de camundongos inoculados com amostra suspeita para diagnostico de raiva.
•  O antígeno rábico, reagindo com o conjugado e iluminado com luz ultravioleta, emite uma luz esverdeada fluorescente. Ou seja, positivo a presença de fluorescência e negativo a ausência de fluorescência.
• Procedimentos:  Identifique as lâminas. Corte fragmentos das diferentes porções do sistema nervoso central (SNC). Toque ligeiramente o fragmento na lâmina, fazendo dois espaços de aproximadamente 1,5cm2 cada, com impressões na mesma lâmina. Deixe secar a lâmina por aproximadamente 15 a 30 minutos. Fixe a lâmina, no mínimo durante 30 minutos, em acetona a -20°C contida em coplin. Retire a lâmina da acetona e deixe-a escorrer e secar. Após a secagem, caso não utilize as lâminas próprias para IF, faça um círculo em torno das impressões com esmalte, para reter o conjugado. Cubra a impressão mais próxima da identificação com a diluição A (cérebro de camundongo normal + conjugado previamente titulado) e a impressão mais distante com a diluição B (CVS + conjugado previamente titulado).  Incube as lâminas por 30 minutos a 37°C em câmara úmida. Enxágue as lâminas com solução salina tamponada (pH entre 7,2 a 7,5), deixando-as por duas vezes submersas em salina durante dez minutos. Enxágue as lâminas com água destilada, para evitar a formação de cristais durante a secagem.  Seque as lâminas. Adicione uma gota de glicerina tamponada (pH em 8,5).  Coloque lamínulas nas duas impressões, A e B. Este mesmo procedimento deve ser feito com as lâminas de controle (material positivo e negativo para raiva). O material utilizado para controle positivo deve ser o cérebro de camundongos infectados com material de rua ou a própria amostra original positiva.
• Nas lâminas com a presença do antígeno poderão ser observadas estruturas de cor verde-maçã dotadas de brilho intenso. Os tamanhos destas inclusões podem ser variados: algumas são pequenas (chamadas de areia ou poeira antigênica) e outras apresentam o tamanho comparável ao dos corpúsculos de Negri.

Prova biológica (MINISTÉRIO DA SAÚDE – 2008)

• O animal de eleição para o isolamento é o camundongo albino suíço, por ser um dos mais sensíveis ao vírus rábico. O animal utilizado deve ser de boa procedência e apresentar bom estado sanitário, com idade e peso adequados.
• Preparo da suspensão a 20% para inoculação. Pese 1 grama dos diferentes fragmentos do SNC, macere-o em gral estéril e adicione ao preparo 4mL de diluente de vírus. Centrifugue o preparo de 2.000 a 3.000g durante 15 minutos. Retire o sobrenadante. Mantenha o preparo em refrigeração (de 2 a 8°C) para inoculá-lo em camundongos, no mesmo dia, por via intracerebral (IC).
• Realize as inoculações IC em camundongos lactentes de até 5 dias (0,01mL por animal) ou em camundongos de 21 dias de idade com 11 a 14 gramas de peso (0,03mL por animal).
• Prepare fichas de identificação e de leitura das amostras que devem ser inoculadas. Inocule de 8 a 10 camundongos por amostra. Realize a leitura dos camundongos inoculados diariamente por 21 dias, no caso de amostras de cães e gatos, e no mínimo 30 dias, no caso de amostras de herbívoros e animais silvestres.
• Anote, nas fichas de leitura, a relação dos animais mortos, doentes e sacrificados. Colete todos os animais mortos a partir do quinto dia da inoculação e os submeta à prova de IFD.
• Para a inoculação, deverão ser utilizadas, preferencialmente, seringas descartáveis de 1mL que permitam a dosagem de 0,03mL e agulhas de calibre 13x4,5, no máximo. Ao final da prova, os animais deverão ser sacrificados com a utilização de equipamentos adequados à eutanásia de animais ou mediante a inalação de éter etílico ou clorofórmio, observando-se as boas práticas laboratoriais.

Observação:

1. As amostras originais recebidas para o diagnóstico laboratorial deverão ser guardadas em congelador (freezer) até o término das provas.

2. Os animais inoculados devem ser mantidos em observação em área ou local próprio (biotério de experimentação ou infectório) separado das demais dependências do laboratório. Não devem ser mantidos na área de criação animal.

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