A CURVA PADRÃO PARA A QUANTIFICAÇÃO DO BSA

Universidade Federal de Minas Gerais [pic 1][pic 2]

Instituto de Ciências Agrárias

Curso: Engenharia de Alimentos

Disciplina: Laboratório de Engenharia Bioquímica

 

         

 

CURVA PADRÃO PARA A QUANTIFICAÇÃO DO BSA (BOVINE SÉRUM ALBUMIN) VIA ESPECTROFOTOMETRIA PELO MÉTODO BRADFORD PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS. 

 

 

Bruna Soares Andrade Gomes

2015066459

 

 

 

Professor: Igor Viana Brandi

 

 

 

 

Montes Claros

2018

OBJETIVOS DA ATIVIDADE

Objetivo geral

• Definir uma curva padrão para a quantificação do BSA (Bovine sérum albumin) via espectrofotometria pelo método Bradford para determinação de proteínas.

Objetivo Específico

• Obter uma solução a partir de uma amostra da Albumina do Soro Bovino (BSA).
• A partir dessa solução proceder diluições para obter concentrações previamente definidas.
• Exercitar a prática de diluição na determinação da concentração bem como o uso de micropipetas automáticas, visando facilitar a prática das normas experimentais que serão realizados ao longo da disciplina.
• Construir a curva de referência com auxílio do programa Excel no computador.

INTRODUÇÃO

A proteína é a mais importante das macromoléculas, sendo abundante e extremamente essencial a todas as células vivas, estão associadas à praticamente todas as atividades fisiológicas, desempenhando um papel fundamental nos sistemas biológicos, fazendo-se pertinentes a todas as formas de vida. Estão presentes em diversos tipos de alimentos e exercem diferentes funções no organismo, são utilizadas na reestruturação de tecidos; operam como catalisadores nas reações químicas que se apresentam nos organismos vivos, incluindo enzimas ou hormônios; são indispensáveis nas reações imunológicas e, juntamente com os ácidos nucléicos, são fundamentais nos fenômenos de crescimento e reprodução.

Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas. Quimicamente, as proteínas são polímeros de alto peso molecular, acima de 10.000, cujas elementos básicos são os aminoácidos, ligados por meio de ligações peptídicas. As características de uma proteína são determinadas pelo número e espécie dos resíduos de aminoácidos, bem como pela sequência desses compostos na molécula.

A elaboração de metodologias e pesquisas espectrofotométricas para a determinação de proteínas e de extrema relevância para especialistas, tanto ligados à indústria de alimentos, quanto para laboratórios de análises clínicas, além de pesquisadores de diversas áreas do conhecimento. O Espectrofotômetro é um equipamento de análise, amplamente empregado em laboratórios de pesquisa, apto a determinar e aferir a quantidade de luz (radiação eletromagnética) absorvida, transmitida ou refletida por uma determinada amostra. O que difere o uso são os principais interferentes no método empregado, procurando continuamente o método mais próprio para cada caso, sempre se atentando com o princípio envolvido no método selecionado.

Se tratando de princípios o método de Bradford é descrito com uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica. Ocorre ligação do corante azul de Coomassie BG-250 com grupos funcionais básicos ou aromáticos das proteínas. Para isto ocorrer, a proteína deve ter estrutura macromolecular, ou seja, de 8-9 ligações peptídicas no mínimo. A ligação ocorre em dois minutos e dura aproximadamente duas horas.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais Utilizados:

• Solução Estoque de BSA 1mg/1mL
• Água destilada
• Espectrofotômetro com comprimento de onda de 400nm
• Cubetas com caminho ótico de 1cm
• Tubos testes
• Balão Volumétrico
• Rack para tubos de testes
• Vortex
• Pipetas graduadas e fracos para preparação e armazenamento de reagente
• Pipetas de precisão de 100ul e 5,0ml
• Becker

Métodos

Procedimento: Separar 4 tubos, no primeiro adicionar 400µL de BSA. Retirar 200µL do primeiro tudo e transferir para o segundo tubo, completá-lo com 200µL de água destilada e homogeneizar no vortex. Retirar 200µL do segundo tubo e transferir para o terceiro tubo, completá-lo com 200µL de água destilada e homogeneizar no vortex. Por fim, retirar 200µL do terceiro tubo e transferir para o quarto tubo, completá-lo com 200µL de água destilada e homogeneizar no vortex. Após este procedimento, retirar 40µL de cada tubo e transferir para um segundo tubo específico para cada diluição e adicionar em cada um 1560µL de água destilada e 400µL de reagente de Bradford.