EXTRAÇÃO, IMOBILIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA INVERTASE DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DE FERMENTO COMERCIAL

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLGIA

Arthur Carmello, Naiara Tabanez, Nathalia de Almeida Santos

Profª. Drª. Ariela Veloso de Paula

EXTRAÇÃO, IMOBILIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA INVERTASE DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DE FERMENTO COMERCIAL

Araraquara

2º SEMESTRE - 2017

RESUMO

A enzima invertase é alvo de grande interesse comercial por ser responsável por catalisar a hidrólise da ligação glicosídica da molécula de sacarose a fim de gerar uma mistura equimolar dos monossacarídeos D-glicose e D-frutose, que recebe o nome de açúcar invertido. Essa enzima é encontrada principalmente em plantas e microrganismos, sendo a levedura Saccharomyces cerevisiae a principal fonte para a produção comercial da enzima. Nesse cenário, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as melhores condições dos processos de engenharia, alterando parâmetros físicos e químicos e realizando a reação de hidrólise em dois reatores distintos operando em modo batelada e em modo contínuo. Foram determinadas as condições ótimas de temperatura e pH, analisando para a enzima invertase livre e invertase imobilizada em gel alginato de cálcio os pHs 3, 4, 5, 6 e 7 e as temperaturas 37°C, 47°C, 57°C e 67°C. Da análise, observou-se que tanto a enzima em sua forma livre quanto imobilizada em gel alginato de cálcio apresentaram pH e temperatura ótima equivalente a 6 e 47°C, respectivamente. Determinou-se a concentração ideal da enzima livre diluindo-se o extrato 10x, 20x, 40x e 80x, onde obteve-se o resultado de que a melhor concentração para a condução dos experimentos equivale ao extrato 20x diluído. Analogamente, para a enzima imobilizada calculou-se o número ideal de pellets realizando a análise para 0, 4, 8, 12, 16 e 20 pellets, onde viu-se que o total de 16 pellets caracteriza-se como o ideal para a progressão dos experimentos. Realizou-se a análise da conversão de sacarose em glicose e frutose empregando-se reator operando em modo batelada para a enzima na forma livre e imobilizada durante 90 minutos, dentro deste tempo observou-se que a invertase imobilizada em alginato de cálcio apresentou melhor taxa de conversão (99,576%) em relação à enzima livre (76,717%). Posteriormente, analisou-se a distribuição do tempo de residência (DTR) a partir do teste de traçador do tipo pulso utilizando o corante verde rápido como traçador. Calculou-se o tempo de residência e o tempo espacial, para os quais obteve-se um resultado equivalente a 29,890 minutos e 19,360, respectivamente. O teste indicou, após o cálculo do percentual de erro, que houve a presença de caminhos preferenciais. Por fim, realizou-se a análise da conversão de sacarose para enzima invertase imobilizada em reator de coluna operando em modo contínuo, desta análise observou-se que a taxa de conversão igual 51,240% não apresentou-se satisfatória, isto devido primordialmente à existência de caminhos preferenciais.

1. Sumário

1.        INTRODUÇÃO        7

2.        REVISÃO BIBLIOGRÁFICA        8

2.1        Enzimas        8

        2.1.1        Enzimas como biocatalisadores        8

2.1.2        Invertase        9

2.2        Enzimas Imobilizadas        10

2.2.1        Métodos de imobilização        11

2.2.2        Suportes para imobilização        12

2.2.3        Efeitos causados pela imobilização        12

2.3        Cinética Enzimática        13

2.4        Reatores Enzimáticos        13

2.4.1        Reatores em modo descontínuo        15

2.4.2 Teste de traçador (DTR)        16

3.        OBJETIVOS        17

3.1        Objetivos específicos        17

4.        MATERIAIS E MÉTODOS        18

4.1        Extração da enzima invertase        18

4.2        Determinação de proteínas totais        18

4.3        Determinação de açúcares redutores por DNS        19

4.4        Determinação da concentração ideal de enzima        19

4.5        Imobilização da enzima invertase        20

4.6 Determinação do pH e temperatura ótima da invertase na forma livre        20

4.7        Determinação da concentração ideal de enzima imobilizada        21

4.8        Determinação do pH e temperatura ótima da invertase na forma imobilizada        21

4.9        Reação em reator de mistura funcionando por sistema de batelada        21

4.10Teste de traçador (DTR)        23

4.11 Reator de coluna operando em modo contínuo        26

5        RESULTADOS E DISCUSSÃO        27

5.1        Determinação de proteínas pelo método de Lowry        27

5.2        Determinação de açúcares redutores a partir do método de DNS        30