Laboratório de Engenharia Bioquímica

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS[pic 1][pic 2]

    INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

Curso de Engenharia de Alimentos

Disciplina: Laboratório de Engenharia Bioquímica

Determinação de Densidade Óptica

Discentes:  Ana Carolina Rocha Santos

Camila Carolina de Sousa Silva

Kessia Lenis Vieira Costa

Patty Vieira

Thays Carolyne Ramos Nascimento

Montes Claros, 26 de setembro de 2016

Introdução

        O crescimento de células de Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura pode ser observado através da sua densidade óptica (D.O.), ao longo do tempo.

A determinação da densidade óptica são os meios mais simples de inferir a concentração de biomassa de microrganismos unicelulares. Embora a avaliação da turbidez de uma cultura bacteriana seja um método rápido esse método é indireto de se estimar a concentração celular.

Lambert (1870), observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte lei: “A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente. ”

        Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra, isto é “ A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substancia absorvente aumenta aritmeticamente.” Assim, quando um feixe de luz passa através de uma suspensão de bactérias, a redução na quantidade de luz transmitida é principalmente consequência do “espalhamento” originado pela massa bacteriana presente.

Um feixe de luz focado numa suspensão microbiana é parcialmente desviado (dispersão da luz) pelas células, e a percentagem de luz não desviada (transmitância, T) é medida por recurso a um espectrofotômetro. A quantidade de luz que atravessa a suspensão celular depende da concentração de células na suspensão e do tamanho destas, do comprimento e onda e da intensidade() da luz incidente e do diâmetro do tubo que contem a suspensão celular. A D.O. da cultura corresponde a absorbância, que é determinada com base na expressão D.O = log (/I), onde  é a intensidade da luz incidente e I é a intensidade da luz transmitida através da suspensão de células.[pic 3][pic 4][pic 5]

Esse método não permite distinguir entre células viáveis e células mortas e não permite obter diretamente valores absolutos da concentração e células, sendo especialmente utilizado quando se pretende confirmar se uma dada cultura se encontra em cresciemento ou para companhar o crescimento bacteriano com base no aumento da D.O. medida a um comprimento de onda particular.

Objetivo

Verificar e acompanhar a multiplicação de células de S.cerevisae durante a fermentação.

Procedimento Experimental

1. Inoculou-se 1 mL da suspensão de S.cerevisaeem 100 mL de meio de cultura (extrato de levedura 2 g/L, peptona de soja 2 g/L e glicose 5 g/L);
2. Homogeneizou-se a cultura e leu-se a densidade óptica inicial (retirando-se da cultura 1 mL) em um espectrofotômetro para medir a absorbância em comprimento de onda visível (540 nm);
3.   Incubou-se a cultura a uma temperatura de aproximadamente 37 °C com agitação constante;
4. A cada 3 horas repetiu-se o procedimento descrito no item 2 para a leitura da absorbância, utilizando como referência, para ajustar o zero, solução salina;
5. De acordo com o aumento da turvação da amostra no decorrer do crescimento bacteriano caso a leitura da absorbância fosse maior que 0,8 realizou-se uma diluição de 1:10 em solução salina 0.9 % para posterior leitura da absorbância;
6. A cada 3 horas (incluindo o tempo zero), retirou-se da cultura 1mL e transferiu-se para eppendorf (duplicata) previamente seco e pesado
7. Centrifugou-se à 8000 rpm por 2 minutos;
8. Retirou-se o sobrenadante e pesou-se novamente o eppendorf mais a amostra;
9. O eppendorf foi acondicionado em estufa a uma temperatura de 60 °C para obtenção do peso seco;
10. Pesou-se o eppendorf.

Resultados e Discussões

A concentração celular pode ser determinada através de vários e diferentes métodos. Um dos métodos mais utilizados para a medida da concentração de células de bactérias é o método da turbidimetria associada ao peso seco. A técnica da turbidimetria é uma técnica sensível, podendo apresentar erros e problema de obter leituras, na mesma faixa do espectro de luz de substancias coloidais que podem participar da suspensão, outro erro seria por conta da rapidez de leitura, já que sabe-se que células rapidamente decantam, o que causariam uma diminuição na absorbância, já que estariam fora do caminho óptico do aparelho.