PURIFICAÇÃO DA LISOZIMA A PARTIR DA CLARA DE OVO EM DIFERENTES DILUIÇÕES UTILIZANDO TROCADOR CATIÔNICO MONOLÍTICO POLIMÉRICO SUPERMACROPOROSO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

PURIFICAÇÃO DA LISOZIMA A PARTIR DA CLARA DE OVO EM DIFERENTES DILUIÇÕES UTILIZANDO TROCADOR CATIÔNICO MONOLÍTICO POLIMÉRICO SUPERMACROPOROSO

                     BOLSISTA: Gabriel Luz Chaves

   ORIENTADOR: Prof. Luís Antônio Minim

Relatório Final, referente ao período de março/2016 a fevereiro/2017, apresentado à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do PIBIC/FAPEMIG.

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

MARÇO/2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

1. RESUMO

PURIFICAÇÃO DA LISOZIMA A PARTIR DA CLARA DE OVO EM DIFERENTES DILUIÇÕES UTILIZANDO TROCADOR CATIÔNICO MONOLÍTICO POLIMÉRICO SUPERMACROPOROSO

A lisozima é uma enzima com elevado potencial de uso nas indústrias farmacêutica e de alimentos devido à sua atividade antimicrobiana, e purificá-la por processos mais rápidos, com custos reduzidos e menor impacto ambiental, que confiram um elevado grau de pureza é de grande interesse. Leitos monolíticos poliméricos supermacroporosos são um avanço e uma promessa nesse sentido, possibilitando o uso de soluções mais concentradas e menos clarificadas, devido à elevada permeabilidade e porosidade que possuem. O potencial dos monólitos poliméricos não vem sendo plenamente explorado na purificação de lisozima a partir da clara do ovo, sendo utilizadas até o momento diluições da matéria-prima entre 5 e 18 vezes. Neste sentido foi avaliado o uso de uma coluna monolítica de troca catiônica para a purificação de lisozima a partir de soluções de clara de ovo livres de ovomucina, diluídas nas proporções 1:2, 1:7 e 1:18, utilizando-se uma única etapa cromatográfica. Para isso, foi utilizada uma solução-tampão de fosfato de sódio 0,02 mol⋅L-1 pH 7,2 como fase móvel e a eluição foi feita adicionando-se 1,0 mol⋅L-1 de NaCl ao tampão. Os picos eluídos foram dialisados e apresentaram 100% de proteína, com grau de pureza entre 42,4% e 78,1%, crescente para soluções menos diluídas, e recuperação em torno de 40%. O uso de leitos monolíticos supermacroporosos na purificação de lisozima mostrou-se promissor, permitindo o uso de soluções de alimentação mais concentradas em um processo com um reduzido número de etapas. Com isso é possível a redução de custos e do consumo de água requerido, minimizando o impacto ambiental do processo.

Data: ___/___/____

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                Prof. Luís Antônio Minim                                          Gabriel Luz Chaves

                ORIENTADOR                                              BOLSISTA PIBIC/FAPEMIG

ÍNDICE

1.INTRODUÇÃO4

2.MATERIAIS E MÉTODOS5

2.1. Material5

2.2. Preparo das soluções de alimentação6

2.3. Purificação da lisozima a partir das soluções de alimentação7

2.4. Análises realizadas9

2.5. Grau de pureza, fator de purificação e rendimentos obtidos10

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES10

4.CONCLUSÕES18

5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS19

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1. INTRODUÇÃO

A demanda das indústrias farmacêutica e de alimentos por biocompostos de fontes naturais é crescente, buscando-se o emprego de técnicas que mantenham ao máximo a bioatividade dos mesmos (Guiochon e Beaver, 2011). A lisozima é uma enzima presente na clara de ovo e em diversos tecidos e fluidos animais (Boesman-Finkelstein e Finkelstein, 1982; Thammasirirak et al., 2006, Başar et al., 2007; Yan et al., 2011). Ela possui grande importância por sua ação bactericida devido à capacidade de hidrólise das β-ligações entre o ácido murâmico e a N-acetil-glicosamina componentes do mucopolissacarídeo das paredes celulares de bactérias, sendo usada como conservante em alimentos e antibiótico pela indústria farmacêutica (Mecitoğlu et al., 2006; Bayramoğlu et al., 2007; Anirudhan e Rejeena, 2012). A lisozima da clara de ovo de galinha é uma proteína pequena, de cadeia única, composta por 129 resíduos de aminoácidos e massa molar em torno de 14300 Da (Canfield, 1963). Possui caráter básico, com seis resíduos de lisina e nove de arginina, e ponto isoelétrico em torno de 11,3 (Wetter e Deutsch, 1951; Dismer e Hubbuch, 2007). Diversas técnicas vêm sendo utilizadas para a purificação da lisozima, como a adsorção (Alderton et al., 1945), cristalização (Alderton e Fevold, 1946), cromatografia com heparina (Boesman-Finkelstein e Finkelstein, 1982), permeação em gel (Awadé et al., 1994), troca aniônica (Vachier et al., 1995), afinidade por corante imobilizado (He e Sun, 2002; Tong et al., 2002; Arica e Bayramoğlu, 2005; Yilmaz et al., 2005) e por íon metálico imobilizado (Sharma e Agarwal, 2002), troca catiônica (Guérin-Dubiard et al., 2005; Thammasirirak et al., 2006; Chiu et al., 2007; Yan et al., 2011), afinidade hidrofóbica (Altıntaş et al., 2007) e ultrafiltração (Mayani et al., 2010). As técnicas cromatográficas prevalecem nos processos empregados, principalmente nas etapas finais em que o grau de pureza requerido é elevado (Jungbauer e Hanh, 2008; Lenhoff, 2011). Dentre elas, a troca iônica, baseada na adsorção diferenciada de compostos carregados (positiva ou negativamente) em uma superfície com cargas opostas, é uma das técnicas mais utilizadas por causar pouco ou nenhum dano à estrutura terciária e consequente perda da bioatividade das mesmas (Dechow, 1997; Roos, 2000). Tal característica é devida à seletividade e capacidade de separação sob condições próximas às fisiológicas, causando menos danos aos compostos (Chen et al., 2010). 117 Uma alternativa aos adsorventes tradicionais são os leitos monolíticos poliméricos supermacroporosos, considerados a quarta geração dos materiais cromatográficos (Jungbauer e Rahn, 2008). Entre eles estão os chamados criogéis, cuja estrutura permite a passagem de soluções de alimentação concentradas e nãoclarificadas, inclusive com células inteiras, o que permite uma redução no número de etapas dos processos de purificação (Arvidsson et al., 2002; Lozinsky et al., 2003). Tais monólitos também são facilmente sintetizados e modificados para adquirir características específicas para o isolamento de compostos de interesse (Plieva et al., 2004; Savina et al., 2005). Monólitos poliméricos modificados para o uso em troca iônica, afinidade, afinidade por metal quelato, imobilização de enzimas, entre outros, vêm sendo reportados (Hanora et al., 2006; Chen et al., 2008; Wang et al., 2008; Li et al., 2009; Erzengin et al., 2011; Sun et al., 2012; Uygun et al., 2012). Outra característica interessante de tal matriz é a baixa resistência ao escoamento e consequente baixa perda de carga ao se escoar um fluido através de um leito monolítico. Com isso soluções menos diluídas podem ser usadas sem afetar a eficiência da extração, otimizando o tempo de processo (Lozinsky et al., 2003; Guiochon, 2007), e reduzindo o consumo de água essencial na redução do impacto ambiental associado às etapas cromatográficas (Nováková et al., 2006; Chen e Kord, 2009). No entanto, estudos que avaliam o efeito da viscosidade ou diluição da alimentação na extração de biocompostos ainda são escassos, em especial com os monólitos poliméricos. Alguns trabalhos com leitos expandidos ou fluidizados vêm sendo feitos, mas sem se avaliar tais características especificamente (Tong et al., 2002; Başar et al., 2007). Além disso, o potencial de utilização dessas matrizes na purificação da lisozima a partir de soluções concentradas vem sendo pouco explorado, com a alimentação sendo diluída entre 5 e 18 vezes (Guérin-Dubiard et al., 2005; Yan et al., 2011). Assim sendo, neste trabalho verificou-se o efeito da diluição na extração da lisozima da clara de ovo utilizando-se um trocador catiônico monolítico polimérico supermacroporoso, abordando-se aspectos relacionados à pureza e rendimento obtidos.